Uma estratégia para sensíveis, Large Scale quantitativos Metabolomics
Summary
Metabolite perfis tem sido um ativo valioso para o estudo do metabolismo na saúde e na doença. Utilizando cromatografia normal em fases líquida acoplada à espectrometria de massa de alta resolução com mudança de polaridade e um ciclo rápido, nós descrevemos um protocolo para analisar a composição metabólica polar de material biológico com alta sensibilidade, precisão e resolução.
Abstract
Metabolite perfis tem sido um ativo valioso para o estudo do metabolismo na saúde e na doença. No entanto, as plataformas atuais têm diferentes fatores limitantes, como o trabalho intensivo preparações de amostra, baixos limites de detecção, velocidades de varredura lenta, otimização de método intensivo para cada metabólito, e a incapacidade de medir tanto positivamente e íons negativamente carregados em experiências individuais. Portanto, um protocolo de metabolômica novela poderia avançar estudos metabolômica. Cromatografia hidrófilo à base de amida permite análise de metabolitos polares sem qualquer transformação química. MS de alta resolução usando o Q-Exactive (QE-MS) melhorou óptica de íons, o aumento da velocidade de varredura (256 ms na resolução 70.000), e tem a capacidade de realizar comutação positivo / negativo. Usando uma estratégia de extracção de metanol frio, e o acoplamento de uma coluna de amida com QE-MS permite a detecção robusta de 168 metabolitos polares alvo e milhares de características adicionais simultaneamente. Datum tratamento é realizado com um software comercialmente disponível de uma maneira altamente eficiente, e características desconhecidas extraídos a partir dos espectros de massa pode ser consultado na base de dados.
Introduction
Metabolomics, definido como um ensaio que mede vários metabolitos simultaneamente, tem sido uma área de grande interesse. Metabolomics fornece uma leitura direta da fisiologia molecular e forneceu insights sobre o desenvolvimento e doenças como o câncer de 1-4. Ressonância magnética nuclear (RMN) e cromatografia gasosa-espectrometria de massa (GC-MS) estão entre os mais utilizados instrumentos 5-9. RMN, especialmente foi usado para experiências de fluxo desde que os compostos marcados de isótopos pesados, tais como 13 C metabolitos marcados, são RMN-activo 10,11. No entanto, esta estratégia requer relativamente elevado grau de pureza da amostra e grande quantidade de amostra, o que limita as suas aplicações em metabolômica. Enquanto isso, os dados recolhidos a partir de RMN precisa de análise intensiva e atribuição composto de espectros de RMN complexo é difícil. GC-MS tem sido amplamente utilizada para os metabolitos polares e estudos de lípidos, mas requer os composto volátilds e, portanto, muitas vezes derivação de metabólitos, o que às vezes envolve química complexa que pode ser demorado e introduz ruído experimental.
Cromatografia líquida (LC) acoplada à espectrometria de massa triplo quadrupolo utiliza o primeiro quadrupolo para selecionar os íons pais intactos, que são fragmentados no segundo quadrupolo, enquanto o terceiro quadrupolo é usado para selecionar fragmentos característicos ou íons filha. Este método, que registra a passagem de íons de pais para filha íons específicos, é denominado de monitoramento de reações múltiplas (MRM). MRM é um método muito sensível, específico e robusto tanto para pequenas moléculas e quantificação de proteínas 12-15,21. No entanto, MRM tem suas limitações. Para alcançar alta especificidade um método MRM precisa ser construído para cada metabólito. Este método consiste na identificação de um fragmento específico de energia de colisão e optimizado, o que requer conhecimento prévio do prope correspondentesrties dos metabólitos de interesse, tais como informações de estrutura química. Portanto, com algumas excepções que envolvem a perda neutra de fragmentos comuns, não é possível identificar metabolitos desconhecidos com este método.
Nos últimos anos, a espectrometria de massa de alta resolução (HRMS) instrumentos foram lançados, como a série LTQ-Orbitrap e Exactive, o QuanTof e TripleTOF 5600 16-18,22. HRMS pode proporcionar um rácio de massa para carga (m / z) de iões intactas dentro de um erro de poucos ppm. Portanto, um instrumento HRMS operado pela detecção de todos os iões de precursor (ou seja, modo de varrimento completo) pode obter informação estrutural directa da massa exacta e a composição elementar resultante da substância a analisar, e esta informação pode ser usada para identificar possíveis metabolitos. Com efeito, todas as informações sobre um composto pode ser obtido com uma massa exacta, até o nível de isómeros estruturais. Além disso, um completométodo de verificação não requer conhecimento prévio de metabólitos e não requer método de otimização. Além disso, uma vez que todos os íons com m / z cair na faixa de varredura pode ser analisado, HRMS tem uma capacidade quase ilimitada em termos de número de metabólitos que podem ser quantificados em uma única corrida em comparação com o método MRM. HRMS é também comparável ao de um MRM quadrupolo triplo da capacidade quantitativa devido ao ciclo de trabalho curto, resultando num número comparável de pontos de dados que podem ser obtidos de uma análise completa do MS. Portanto, HRMS proporciona uma abordagem alternativa para o metaboloma quantitativos. Recentemente, uma versão melhorada do HRMS denominada espectrometria de massa Q-Exactive (QE-MS) pode ser operado sob a comutação entre os modos positivos e negativos com tempos de ciclo suficientemente rápido em um único método, o que amplia o alcance de detecção 19. Aqui nós descrevemos a nossa estratégia metabolômica usando o QE-MS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os passos mais críticos para perfilamento metabolito bem sucedida em células, utilizando este protocolo são: 1) o controlo do meio de crescimento e extracção cuidadosa das células; 2) ajustar o método de LC com base em MS configuração método para garantir que não são suficientes (geralmente pelo menos 10) pontos de dados em um pico para a quantificação; 3) fazer uma calibragem baixa massa antes de executar amostras; 4) a injecção de não mais do que 5 ml de evitar um tempo de retenção de deslocamento e…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer Detlef Schumann, Jennifer Sutton (Thermo Fisher Scientific) e Nathaniel Snyder (Universidade da Pensilvânia) pelas valiosas discussões sobre calibração de massa e processamento de dados. A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional do Câncer dos Institutos Nacionais de Saúde sob Award Número R00CA168997. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva de seus autores e não representam, necessariamente, a posição oficial do National Institutes of Health.
Materials
| Positive calibration mix | Thermo Scientific | #88323 | It is light sensitive. Store at 4 °C |
| Negative calibration mix | Thermo Scientific | #88324 | Store at 4 °C |
| Diazinon | Sant Cruz Biotechnology | #C0413 | It causes eyes irritation, so work in hood. Store at 4 °C |
| H-ESI needle insert | Fisher Scientific | #1303200 | This could be replaced or cleaned with 5 % Formic acid/water (remove rubber ring) if clogged. |
| Xbridge amide column | Waters | #186004860 | Guard column is recommend to increase column lifetime. |
References
- Fiehn, O. Combining genomics, metabolome analysis, and biochemical modelling to understand metabolic networks. Comparative and Functional Genomics. 2 (3), 155-168 (2001).
- Mulleder, M., et al. A prototrophic deletion mutant collection for yeast metabolomics and systems biology. Nature Biotechnology. 30 (12), 1176-1178 (2012).
- Patel, V. R., Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P., Baldi, P. CircadiOmics: Integrating circadian genomics, transcriptomics, proteomics and metabolomics. Nature Methods. 9 (8), 772-773 (2012).
- Ideker, T., et al. Integrated genomic and proteomic analyses of a systematically perturbed metabolic network. Science. 292 (5518), 929-934 (2001).
- Jonsson, P., et al. A strategy for identifying differences in large series of metabolomic samples analyzed by GC/MS. Analytical Chemistry. 76 (6), 1738-1745 (2004).
- Jonsson, P., et al. High-throughput data analysis for detecting and identifying differences between samples in GC/MS-based metabolomic analyses. Analytical Chemistry. 77 (17), 5635-5642 (2005).
- Weljie, A. M., Newton, J., Mercier, P., Carlson, E., Slupsky, C. M. Targeted profiling: Quantitative analysis of 1H NMR metabolomics data. Analytical Chemistry. 78 (13), 4430-4442 (2006).
- Wiklund, S., et al. Visualization of GC/TOF-MS-based metabolomics data for identification of biochemically interesting compounds using OPLS class models. Analytical Chemistry. 80 (1), 115-122 (2008).
- Xia, J., Bjorndahl, T. C., Tang, P., Wishart, D. S. MetaboMiner–semi-automated identification of metabolites from 2D NMR spectra of complex biofluids. BMC Bioinformatics. 9, 507 (2008).
- Lu, D., et al. 13C NMR isotopomer analysis reveals a connection between pyruvate cycling and glucose-stimulated insulin secretion (GSIS). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (5), 2708-2713 (2002).
- Shen, J., et al. Determination of the rate of the glutamate/glutamine cycle in the human brain b. in vivo 13C NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (14), 8235-8240 (1999).
- Kitteringham, N. R., Jenkins, R. E., Lane, C. S., Elliott, V. L., Park, B. K. Multiple reaction monitoring for quantitative biomarker analysis in proteomics and metabolomics. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 877 (13), 1229-1239 (2009).
- Locasale, J. W., et al. Metabolomics of human cerebrospinal fluid identifies signatures of malignant glioma. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 11 (6), 10-1074 (2012).
- Wolf-Yadlin, A., Hautaniemi, S., Lauffenburger, D. A., White, F. M. Multiple reaction monitoring for robust quantitative proteomic analysis of cellular signaling networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (14), 5860-5865 (2007).
- Yuan, M., Breitkopf, S. B., Yang, X., Asara, J. M. A positive/negative ion-switching, targeted mass spectrometry-based metabolomics platform for bodily fluids, cells, and fresh and fixed tissue. Nature Protocols. 7 (5), 872-881 (2012).
- Ramanathan, R., et al. It is time for a paradigm shift in drug discovery bioanalysis: From SRM to HRMS. Journal of Mass Spectrometry : JM. 46 (6), 595-601 (2011).
- Lu, W., Clasquin, M. F., Melamud, E., Amador-Noguez, D., Caudy, A. A., Rabinowitz, J. D. Metabolomic analysis via reversed-phase ion-pairing liquid chromatography coupled to a stand alone orbitrap mass spectrometer. Analytical Chemistry. 82 (8), 3212-3221 (2010).
- Michalski, A., et al. Ultra high resolution linear ion trap orbitrap mass spectrometer (orbitrap elite) facilitates top down LC MS/MS and versatile peptide fragmentation modes. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 11 (3), 10-1074 (2012).
- Michalski, A., et al. Mass spectrometry-based proteomics using Q exactive, a high-performance benchtop quadrupole orbitrap mass spectrometer. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 10 (9), (2011).
- Snyder, N. W., Khezam, M., Mesaros, C. A., Worth, A., Blair, I. A. Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry. UPLC-HRMS). J. Vis. Exp. (75), (2013).
- Gika, H. G., Theodoridis, G. A., Wingate, J. E., Wilson, I. D. Within-day reproducibility of an HPLC-MS-based method for metabonomic analysis: Application to human urine. Journal of Proteome Research. 6 (8), 3291-3303 (2007).
- Want, E. J., et al. Global metabolic profiling procedures for urine using UPLC-MS. Nature Protocols. 5 (6), 1005-1018 (2010).
