تلطيخ النسيجية من<em> نبات الأرابيدوبسيس thaliana</em> الخليوي الثانوية ستريت عناصر
Summary
Plant cell wall composition varies between tissue types and can include lignin, cellulose, hemicelluloses, and pectin. Various staining techniques have been developed to visualize differences at the cell-type level. This paper is a compilation of commonly used cell wall staining techniques.
Abstract
Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively in the study of secondary cell wall formation. Secondary cell wall deposition occurs after the primary cell wall is laid down, a process carried out exclusively by specialized cells such as those forming vessel and fiber tissues. Most secondary cell walls are composed of cellulose (40–50%), hemicellulose (25–30%), and lignin (20–30%). Several mutations affecting secondary cell wall biosynthesis have been isolated, and the corresponding mutants may or may not exhibit obvious biochemical composition changes or visual phenotypes since these mutations could be masked by compensatory responses. Staining procedures have historically been used to show differences on a cellular basis. These methods are exclusively visual means of analysis; nevertheless their role in rapid and critical analysis is of great importance. Congo red and calcofluor white are stains used to detect polysaccharides, whereas Mäule and phloroglucinol are commonly used to determine differences in lignin, and toluidine blue O is used to differentially stain polysaccharides and lignin. The seemingly simple techniques of sectioning, staining, and imaging can be a challenge for beginners. Starting with sample preparation using the A. thaliana model, this study details the protocols of a variety of staining methodologies that can be easily implemented for observation of cell and tissue organization in secondary cell walls of plants.
Introduction
جدار الخلية النباتية يحمل مجموعة كبيرة من المعلومات ضمن مختلف مكوناته: اللجنين، السليلوز، hemicelluloses (الزيلان، glucuronoxylan، xyloglucan، arabinoxylan، الربط المختلطة جلوكان، أو glucomannan)، والبكتين. توفير التقنيات النسيجية الإشارات البصرية الهامة في دراسة الاختلافات داخل جدران الخلايا الثانوية في المستويات التنظيمية والخلوية. تم تطوير تقنيات النسيجية المختلفة ويمكن العثور عليها في الأدب، ولكن يمكن لهذه التقنيات أن يكون تحديا للمبتدئين وتستغرق وقتا طويلا لأن بروتوكولات مفصلة جدا مع تعليمات بسيطة ونادرا ما تكون مرئية إذا كان متوفرا من أي وقت مضى. الهدف من هذه الدراسة هو تقديم الإرشادات البسيطة لتقنيات تلطيخ النسيجية للحصول على صور عالية الجودة.
باجتزاء الأنسجة الجذعية هي الخطوة الأولى في التصور من جدران الخلايا والأشكال الخلية. على الرغم من المقاطع ومن ناحية القص غير مكلفة وتستغرق وقتا أقل للتحضير، واستخدام vibratome يقدم الاتساق وتعطي صور عالية الجودة. باستخدام vibratome يسمح إنتاج أفضل نوعية البيانات عن طريق توليد أقسام حتى مع نفس السمك، مما يساعد على إنتاج صور حادة ويقلل بشكل ملحوظ من خطر ينتج عنها اختلافات دقيقة بين العينات التي من شأنها أن يكون سبب ذلك ببساطة عن طريق إعداد عينة سيئة. يمكن باستخدام راتنجات لإصلاح العينات الطازجة يكون تحديا للمبتدئين ويمكن أن تكون لا تزال تستغرق وقتا طويلا حتى بالنسبة للخبراء عندما يحتاج تحليلا ينبغي القيام به بسرعة. بالإضافة إلى ذلك، يصبح من المستحيل لقياس أي نشاط بيولوجي مع العينة عندما تم تضمين ذلك في الراتنج. أسلوب واحد بسيط هو أن توظف الاغاروز والعفن محلية الصنع هي مفيدة لتضمين الأنسجة الجذعية، ويمكن أيضا أن تستخدم في تطبيقات أخرى تتطلب تشريح الأنسجة الرخوة. بالمقارنة مع تضمين العينات في الراتنج، وهذا الأسلوب له ميزة الحفاظ على الأنسجة على قيد الحياة والحد من التلاعب العينة. باجتزاء الأنسجة عن طريق vibratome هو دقيق للغاية ويولد homogenأقسام الأوس، والتي، اعتمادا على الهدف من الدراسة، ومن ثم يمكن استخدامها مع العديد من التقنيات تلطيخ مختلفة.
أبسط الطرق لتصور اللجنين والمواد العطرية الأخرى تستخدم الأشعة فوق البنفسجية (UV) ضوء. الإثارة من الجزيئات العطرية مقرها من قبل ضوء الأشعة فوق البنفسجية هي تقنية قديمة، ولكنها لا تزال واحدة من أسرع النهج لرؤية اللجنين. ومع ذلك، والتصور للأشعة فوق البنفسجية هو في الواقع ليست مثالية للكشف عن اللجنين لضوء الأشعة فوق البنفسجية سوف تثير العطرية الأخرى. يتكون اللجنين في المقام الأول من ثلاث كتل بناء، وmonolignols (الكحول hydroxycinnamyl: الكحول coniferyl والكحول sinapyl، وف coumaryl الكحول) 1-3. يمكن فلوروغلوسين صمة عار توفر أدلة على مدى cinnamaldehydes الموجودة في الخشب والألياف والأنسجة القصبة الهوائية 4. فلوروغلوسين يعد مؤشرا جيدا من cinnamaldehydes العامة ويمكن التفريق بين cinnamaldehydes والعطرية الأخرى. ويمكن الكشف عن الكحول مونومرات sinapylومتمايزة عن طريق استخدام مولي وصمة عار. طولويدين يا الأزرق هو صبغة متعدد الألوان، ولديه القدرة وصمة عار عناصر مختلفة من جدار الخلية في ألوان مختلفة 5،6 بالتالي. الاستخدام الرئيسي للطولويدين يا الأزرق هو للكشف عن البكتين واللجنين 5،6. ميزة استخدام طولويدين يا الأزرق هو أن العديد من عناصر جدار الخلية يمكن تصور في خطوة واحدة. كلا calcofluor الأبيض والكونغو الحمراء هي سهلة للعمل مع، ويمكن استخدامها لتصور السليلوز. Calcofluor البقع البيضاء السليلوز، callose، وغيرها من β جلوكان غير استبداله أو استبداله ضعيفة 6-9، في حين الكونغو البقع الحمراء مباشرة إلى β (1 → 4) جلوكان وبشكل خاص لالسيليلوز 10،11. الهدف من هذه الدراسة هو تقديم الإرشادات البسيطة لاستخدام التقنيات تلطيخ المذكورة أعلاه للحصول على صور عالية الجودة من A. ينبع thaliana.
Protocol
Representative Results
Discussion
وتستخدم على نطاق واسع أقسام الجذعية A. thaliana لدراسة تنظيم الخلايا في جدار الخلية والثانوية لدراسة نوعيا الاختلافات بين نوع البرية والنباتات المعدلة وراثيا. التقنيات المستخدمة عادة لباجتزاء العينات هي قطع اليد المباشر؛ أو عندما هي جزء لا يتجزأ العينات في الاغارو…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن ممتنون لسابين رسل للمساعدة التحرير. وكان هذا العمل جزءا من معهد الطاقة الحيوية المشتركة وزارة الطاقة (http://www.jbei.org) بدعم من وزارة الطاقة الأميركية، مكتب العلوم ومكتب بحوث البيولوجية والبيئية، من خلال عقد DE-AC02-05CH11231 بين لورانس بيركلي مختبر الوطني ووزارة الطاقة الأميركية.
Materials
| Agarose | EMD | MERC2125 | CAS Number: 9012-36-6 |
| Phloroglucinol | Sigma | P 3502 | 1,3,5-trihydroxybenzene [CAS Number: 108-73-6] |
| Hydrochloric Acid | EMD | HX0603-75 | CAS Number: 7647-01-0 |
| Ammonium hydroxide | EMD | AX1303-6 | CAS Number: 1336-21-6 |
| Toulidine Blue O | Sigma | T3260 | Blutene chloride, Tolonium Chloride [CAS Number 92-31-9] |
| Potassium permanganate | Sigma | 223468 | CAS Number 7722-64-7 |
| Ethanol 190 proof | KOPTEC | V1401 | CAS Number: 64-17-5 |
| Congo Red | Sigma | C6277 | Disodium 3,3'-[[1,1'-biphenyl]-4,4'-diylbis(azo)]bis(4-aminonaphthalene 1-sulphonate) [CAS Number 573-58-0 ] |
| Fluorescent Brightener 28/ Calcofluor White Stain | Sigma | F3543 | 4,4'-Bis[4-[bis(2-hydroxyethyl)amino]-6-anilino-1,3,5-triazin-2-yl]amino]stilbene-2,2'-disulphonic acid [CAS Number 4404-43-7] |
| Vibratome | Leica | Leica Vibrating blade microtome VT1000S | http://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/ |
| Razor | American Safety razor company | Item # 60-0139-0000 | Stainless Steel Double Edge Blade (Personna Super) |
| Screw Cap Microcentrifuge Tubes (2ml) | VWR | 16466-044 | |
| Microcentrifuge Tubes (0.6ml) | Axygen Scientific | MCT-060-C | |
| Mitt | Bel-Art | 380000000 | SCIENCEWARE Hot Hand Protector Mitt |
| Tissue adhesive | Ted Pella Inc | 10033 | Store at 4°C or 20°C for 3 months or longer storage |
| Microwave | Panasonic | NN-SD762S | PELCO Pro CA 44 Instant tissue adhesive |
| Camera with CCD chip with no mechanical shutter | Hamamatsu | C4742-95 | |
| High speed color camera | QImaging | MicroPublisher 5.0 RTV | |
| Camera software | Molecular Devices | MetaMorph version 7.7.0.0 | |
| Imagining anaylsis | Adobe | Photoshop CS4 | |
| Micro Cover Glasses, Square, No.1 | VWR | 48366-067 | 22 x 22 mm (7/8 x 7/8")-Cover glasses are corrosion-resistant and uniformly thick and flat. No. 1 thickness is 0.13 to 0.17mm. |
| Frosted Micro Slides, 1mm | VWR | 48312-003 | 75 x 25 mm- 1mm |
| TX2 Filter cube | Leica | 11513851/11513885 | Filter used for Congo red analysis with a band-pass of 560/40. |
| Parafilm M | Alcan packaging | BRNDPM998 |
References
- Boerjan, W., Ralph, J., Baucher, M. Lignin biosynthesis. Annual review of plant biology. 54, 519-546 (2003).
- Vanholme, R., Demedts, B., Morreel, K., Ralph, J., Boerjan, W. Lignin biosynthesis and structure. Plant physiology. 153, 895-905 (2010).
- Humphreys, J. M., Chapple, C. Rewriting the lignin roadmap. Current opinion in plant biology. 5, 224-229 (2002).
- Adler, E. Lignin chemistry—past, present and future. Wood Sci. Technol. 11, 169-218 (1977).
- Brien, T. P., Feder, N., McCully, M. E. Polychromatic Staining of Plant Cell Walls by Toluidine Blue. 59, 368-373 (1964).
- Mori, B., Bellani, L. M. Differential staining for cellulosic and modified plant cell walls. Biotechnic & histochemistry: official publication of the Biological Stain Commission. 71, 71-72 (1996).
- Maeda, H., Ishida, N. Specificity of binding of hexopyranosyl polysaccharides with fluorescent brightener. Journal of biochemistry. 62, 276-278 (1967).
- Wood, P. J. Specificity in the interaction of direct dyes with polysaccharides. Carbohydrate Research. 85, 271-287 (1980).
- Hughes, J., McCully, M. E. The use of an optical brightener in the study of plant structure. Stain technology. 50, 319-329 (1975).
- Verbelen, J. P., Kerstens, S. Polarization confocal microscopy and congo red fluorescence: a simple and rapid method to determine the mean cellulose fibril orientation in plants. Journal of microscopy. 198, 101-107 (2000).
- Anderson, C. T., Carroll, A., Akhmetova, L., Somerville, C. Real-time imaging of cellulose reorientation during cell wall expansion in Arabidopsis roots. Plant physiology. 152, 787-796 (2010).
- Liljegren, S. Phloroglucinol Stain for Lignin. Cold Spring Harbor Protocols. , (2010).
- Nakano, J., Meshitsuka, G., lin, S., Dence, C. . The Detection of Lignin Methods in Lignin Chemistry. , (1992).
- Sibout, R., et al. CINNAMYL ALCOHOL DEHYDROGENASE-C and -D are the primary genes involved in lignin biosynthesis in the floral stem of Arabidopsis. The Plant cell. 17, 2059-2076 (2005).
- Teather, R. M., Wood, P. J. Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen. Applied and environmental microbiology. 43, 777-780 (1982).
- Yeung, E. A beginner’s guide to the study of plant structure. Proceedings of the 19th Workshop/Conference of the Association for Biology Laboratory Education (ABLE. 19, 365-36 (1998).
- Turner, S. R., Somerville, C. R. Collapsed xylem phenotype of Arabidopsis identifies mutants deficient in cellulose deposition in the secondary cell wall). The Plant Cell Online. 9, 689-701 (1997).
- Iiyama, K., Pant, R. The mechanism of the Mäule colour reaction. Introduction of methylated syringyl nuclei into softwood lignin. Wood Sci. Technol. 22, 167-175 (1988).
- Yang, F., et al. Engineering secondary cell wall deposition in plants. Plant biotechnology journal. 11, 325-335 (2013).
- Zhong, R., Ripperger, A., Ye, Z. H. Ectopic deposition of lignin in the pith of stems of two Arabidopsis mutants. Plant physiology. 123, 59-70 (2000).
- Chapple, C. C., Vogt, T., Ellis, B. E., Somerville, C. R. An Arabidopsis mutant defective in the general phenylpropanoid pathway. The Plant cell. 4, 1413-1424 (1992).
- Fagard, M., et al. PROCUSTE1 Encodes a Cellulose Synthase Required for Normal Cell Elongation Specifically in Roots and Dark-Grown Hypocotyls of Arabidopsis. The Plant Cell Online. 12, 2409-2423 (2000).
