В естественных условиях Сшивание подход к Изолировать белковых комплексов С Дрозофилы Эмбрионы
Summary
Многокомпонентные белковые комплексы играют важнейшую роль в процессе клеточного функции и развития. Здесь мы описываем способ, используемый для изоляции нативные белковые комплексы из эмбрионов Drosophila после сшивания в естественных условиях с последующей очисткой сшитых комплексов для последующего анализа структуры и функции.
Abstract
Многие клеточные процессы управляются мультисубъединичных белковых комплексов. Часто эти комплексы образуют временно и требуют родную среду собираться. Поэтому идентифицировать эти функциональных белковых комплексов важно стабилизации им в естественных лизиса до и последующем очистки. Здесь мы опишем метод, используемый для выделения больших добросовестных белковые комплексы из эмбрионов дрозофилы. Этот метод основан на эмбриона проницаемости и стабилизации комплексов внутри эмбрионов в естественных условиях по сшивки с использованием низкую концентрацию формальдегида, который может легко через клеточную мембрану. Затем белковый комплекс, представляющий интерес, иммунологически последующей гелевой очисткой и анализировали с помощью масс-спектрометрии. Проиллюстрируем этот метод, используя очистку белкового комплекса Tudor, что очень важно для развития зародышевой линии. Тудор большой белок, который содержит несколько доменов Тудор – маленькиймодулей, которые взаимодействуют с метилированных аргинина или лизина целевых белков. Этот способ может быть адаптирован для выделения нативных белковых комплексов из различных организмов и тканей.
Introduction
Выделение мультисубъединичных белковых агрегатов и ДНК-или РНК-белковых комплексов выполняется для выявления белковых комплексов, геномной локусов признанный ДНК-связывающих регуляторных белков или РНК-мишеней РНК-связывающих белков. Различные методы позволяют генома выявления участков ДНК, признанных факторов транскрипции или белков хроматина (чип-SEQ) 1 и РНК-мишеней, связанных с данным РНК-связывающего белка (CLIP-след) 2. Библиотеки РНК, полученных кДНК или целей ДНК затем глубоко секвенировали. Эти методы используют химическую или ультрафиолетовым излучением сшивания для стабилизации комплексов с последующим иммунопреципитации (IP) с антителом против белкового компонента исследуемого комплекса.
Во время развития организма, многие белковые комплексы образуют временно. Поэтому, крайне важно проанализировать состав и функции этих комплексов в естественных условиях, чтобы понять молекулярные механизмы, которые управляют Development. Такой анализ в естественных условиях было бы лучше, экстракорпоральное подхода в так как практически невозможно воспроизвести родной концентрации взаимодействующих компонентов и сотовой биохимической среде в пробирке. Здесь мы продемонстрировать естественных условиях подход в том, что мы успешно использовать для изоляции больших белковых комплексов из эмбрионов дрозофилы. В этом способе белковые комплексы в живых эмбрионов сшиты с низкой концентрацией формальдегида и впоследствии белковые комплексы, представляющие интерес, выделяют IP с антителом против известного компонента комплексов с последующим очисткой на геле комплексов и масс-спектрометрического анализа в идентифицировать неизвестные сложные компоненты. Так как формальдегид способен проникать через клеточную мембрану и имеет сшивающий спектр 2,3-2,7 A 3, белковые комплексы могут быть сшиты в естественных условиях и сложные компоненты, вероятно, будут близки друг к другу. В этой статье мыописать этот метод, используя изоляцию Тудор (Tud) белкового комплекса в качестве примера. Tud является зародышевой линии белок, который имеет важное значение для развития зародышевой линии 4-7. Этот белок содержит 11 TUD домены известных взаимодействовать с метилированных аргинина или лизина других полипептидов 8-10.
Ранее мы сформировали трансгенного Drosophila линию, выражающую HA-меткой функциональная Tud 5 и поэтому, конкретных анти-HA антитела используется для снести TUD комплекс после сшивания.
В дополнение к белок-белковых сшивок, формальдегид может генерировать нуклеиновых кислот белковых сшивок и используется в чип-след экспериментов. Кроме того, у дрозофилы, в естественных условиях сшивания с формальдегидом позволило выявить РНК цели Васа РНК геликазы белка 11.
В то время как в этой статье мы опишем метод в естественных условиях сшивки и пурфикация белковых комплексов из эмбрионов Drosophila, этот метод может быть адаптирован для других организмов и тканей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Формальдегид широко применяется в качестве сшивающего реагента для выявления белок-белковых взаимодействий и белок-нуклеиновая кислота. Его хорошую растворимость и проницаемость клеточной мембраны вместе с совместимостью с процедурами ниже по течению масс-спектрометрии, чтобы фор?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Иордания Дэвис, Яньнянь Лин, Эрик Schädler и Jimiao Чжэн за техническую помощь в этом исследовании. Эта работа была поддержана NSF КАРЬЕРА предоставить MCB-1054962 для ALA
Materials
| Drosophila agar | Lab Scientific (http://www.labscientific.com/) | FLY-8020-1 | Do not autoclave the water and agar mix for prolonged period of time as it will cause the apple juice plates to become fragile |
| Methyl 4-hydroxybenzoate | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | H5501 | Other name: TEGOSEPT |
| Population cage | Flystuff (http://www.flystuff.com/) | 59-104 | |
| Fine nylon mesh | Flystuff (http://www.flystuff.com/) | 57-102 | When making the collection basket, cut the mesh slightly larger than the opening of the falcon tube cap to ensure a tight seal |
| Dounce homogenizer | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | D8938-1SET | Chill the homogenizer on ice and prerinse with cold lysis buffer before use to prevent protein degradation |
| Protease inhibitor cocktail | Roche (http://www.rocheusa.com/portal/usa) | 4693132001 | PBS could be used to prepare concentrated protease inhibitor stock solution |
| Anti-HA agarose beads | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | The kit also includes HA-peptide and spin columns |
| HA-peptide | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | Prepare to 2 mg/ml with PBS |
| Spin Column | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | Spin columns are included as part of the kit |
| Isopropanol | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP26324 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP151-500 | |
| Heptane | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | H350-4 | |
| PBS | Invitrogen (https://www.lifetechnologies.com/us/en/home.html) | AM9625 | Dilute from 10 X to 1 X with nanopure water before use |
| Formaldehyde | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP531-500 | |
| Glycine | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0724 | |
| SDS | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0301 | |
| Urea | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0730 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | P7626-1G | Prepare 200 mM stock solution in isopropanol then dilute to working concentration of 2 mM in lysis buffer |
| IGEPAL CA-630 | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | I8896-50ML | |
| Tween 20 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP337-100 | |
| 15-ml tubes | USA Scientific (http://www.usascientific.com/) | 1475-0511 | |
| Bleach | Clorox brand | Dilute with equal volume of nanopure water to make 50% bleach | |
| 50-ml tubes | BD Biosciences (http://www.bdbiosciences.com/home.jsp) | 352098 | |
| Top layer sieve | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | 04-884-1AK | |
| Bottom layer sieve | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | 04-884-1BA |
References
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome research. 22, 1813-1831 (2012).
- Murigneux, V., Sauliere, J., Roest Crollius, H., Le Hir, H. Transcriptome-wide identification of RNA binding sites by CLIP-seq. Methods. , (2013).
- Sutherland, B. W., Toews, J., Kast, J. Utility of formaldehyde cross-linking and mass spectrometry in the study of protein-protein interactions. Journal of mass spectrometry : JMS. 43, 699-715 (2008).
- Creed, T. M., Loganathan, S. N., Varonin, D., Jackson, C. A., Arkov, A. L. Novel role of specific Tudor domains in Tudor-Aubergine protein complex assembly and distribution during Drosophila oogenesis. Biochemical and biophysical research communications. 402, 384-389 (2010).
- Arkov, A. L., Wang, J. Y., Ramos, A., Lehmann, R. The role of Tudor domains in germline development and polar granule architecture. Development. 133, 4053-4062 (2006).
- Boswell, R. E., Ptudor Mahowald, A. a gene required for assembly of the germ plasm in Drosophila melanogaster. Cell. 43, 97-104 (1985).
- Thomson, T., Lasko, P. Drosophila tudor is essential for polar granule assembly and pole cell specification, but not for posterior patterning. Genesis. 40, 164-170 (2004).
- Arkov, A. L., Ramos, A. Building RNA-protein granules: insight from the germline. Trends in cell biology. 20, 482-490 (2010).
- Gao, M., Arkov, A. L. Next generation organelles: Structure and role of germ granules in the germline. Molecular reproduction and development. , (2012).
- Liu, H., et al. Structural basis for methylarginine-dependent recognition of Aubergine by Tudor. Genes & development. 24, 1876-1881 (2010).
- Liu, N., Han, H., Lasko, P. Vasa promotes Drosophila germline stem cell differentiation by activating mei-P26 translation by directly interacting with a (U)-rich motif in its 3. UTR. Genes & development. 23, 2742-2752 (2009).
- Matthews, K. A., Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. A. Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Methods in Cell Biology. 44, 13-32 (1995).
- Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular cloning: A laboratory manual. , (2001).
- Thomson, T., Liu, N., Arkov, A., Lehmann, R., Lasko, P. Isolation of new polar granule components in Drosophila reveals P body and ER associated proteins. Mechanisms of development. 125, 865-873 (2008).
- Vasilescu, J., Guo, X., Kast, J. Identification of protein-protein interactions using in vivo cross-linking and mass spectrometry. Proteomics. 4, 3845-3854 (2004).
- Klockenbusch, C., Kast, J. Optimization of formaldehyde cross-linking for protein interaction analysis of non-tagged integrin beta1. J Biomed Biotechnol. 2010, 9275-9285 (2010).
- Nowak, D. E., Tian, B., Brasier, A. R. Two-step cross-linking method for identification of NF-kappaB gene network by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 39, 715-725 (2005).
- Zeng, P. Y., Vakoc, C. R., Chen, Z. C., Blobel, G. A., Berger, S. L. In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 41, 694 (2006).
- Liu, N., Dansereau, D. A., Lasko, P. Fat facets interacts with vasa in the Drosophila pole plasm and protects it from degradation. Current biology : CB. 13, 1905-1909 (2003).
