In vivo גישת Crosslinking לבודד חלבון מן מכלולים דרוזופילה עוברים
Summary
קומפלקסי חלבונים מרובים רכיבים ממלאים תפקידים חיוניים בתפקוד ופיתוח סלולריים. כאן אנו מתארים שיטה המשמשת לבודד חלבון מתחמי יליד מעוברי דרוזופילה לאחר in vivo crosslinking ואחריו טיהור של מתחמי crosslinked לניתוח מבנה פונקציה שלאחר מכן.
Abstract
תהליכים תאיים רבים נשלטים על ידי קומפלקסי חלבוני multisubunit. לעתים קרובות מתחמים אלה מהווים transiently ודורשים סביבה מקורית להרכבה. לכן, כדי לזהות קומפלקסי חלבונים פונקציונליים אלה, חשוב לייצב אותם in vivo לפני תמוגה תא וטיהור שלאחר מכן. כאן אנו מתארים שיטה המשמשת לבודד מתחמים גדולים בתום לב חלבון מעוברי דרוזופילה. שיטה זו מבוססת על permeabilization עובר וייצוב של מתחמים בתוך את העוברים על ידי in vivo crosslinking באמצעות ריכוז נמוך של פורמלדהיד, אשר יכול בקלות לחצות את קרום התא. בהמשך לכך, מורכב החלבון של עניין הוא immunopurified ואחריו טיהור ג'ל ונותח על ידי ספקטרומטריית מסה. אנו מדגימים שיטה זו באמצעות טיהור של חלבון מורכב טיודור, שהוא חיוני להתפתחות תאי מין. טיודור הוא חלבון גדול, המכיל תחומים טיודור מרובים – קטןמודולים כי אינטראקציה עם arginines או lysines מפוגלים של חלבוני יעד. שיטה זו יכולה להיות מותאמת לבידוד של קומפלקסי חלבוני יליד מהאורגניזמים ורקמות שונים.
Introduction
בידוד של מכלולי חלבון multisubunit ומתחמי ה-DNA או RNA-חלבון מתבצע לזהות קומפלקסי חלבונים, לוקוסים הגנומי מוכרים על ידי חלבוני רגולטורים-DNA מחייבת או מטרות RNA של חלבוני RNA מחייבים. שיטות שונות מאפשרות זיהוי הגנום של אתרי ה-DNA המוכרים על ידי גורמי שעתוק או חלבוני הכרומטין (שבב-seq) 1 ומטרות RNA הקשורים בחלבון נתון מחייב-RNA (CLIP-seq) 2. הספריות של cDNAs נגזר RNA או DNA מטרות מכן רצף עמוק. שיטות אלה משתמשות כימיות או cross-linking כדי לייצב את מתחמים ואחרי immunoprecipitation (IP) עם נוגדנים נגד מרכיב חלבון של המתחם למד מושרה UV.
במהלך ההתפתחות של האורגניזם, קומפלקסי חלבונים רבים יוצרים transiently. לכן, זה הכרחי כדי לנתח את ההרכב ותפקוד של קומפלקסים אלה in vivo כדי להבין את המנגנונים המולקולריים השולטים development. ניתוח כזה in vivo יהיה מעולה במבחנת גישה שכן הוא כמעט בלתי אפשרי לשחזר ריכוזי יליד מרכיבי האינטראקציה והסביבה ביוכימית תאית במבחנה. כאן אנו מדגימים vivo בגישה שאנחנו בהצלחה להשתמש כדי לבודד את מערכות חלבון גדולות מעוברי דרוזופילה. בשיטה זו, קומפלקסי חלבונים בעוברי החיים הם crosslinked עם ריכוז נמוך של פורמלדהיד, ולאחר מכן מתחמי חלבון של עניין מבודדים על ידי IP עם נוגדנים נגד מרכיב ידוע של מתחמים ואחריו טיהור ג'ל של מתחמים וניתוח ספקטרומטריית מסה כדי לזהות רכיבים מורכבים לא ידועים. מאז פורמלדהיד הוא מסוגל לחדור את קרום התא ויש לו מגוון crosslinking של 2.3-2.7 3, ניתן crosslinked קומפלקסי חלבוני in vivo והרכיבים המורכבים צפויים להיות קרוב אחד לשני. שבמאמר זהמתאר שיטה זו באמצעות הבידוד של טיודור (TUD) חלבון מורכב לדוגמא ירושלים. TUD הוא חלבון בתאי מין שהוא חיוני להתפתחות תאי המין 4-7. חלבון זה מכיל 11 תחומים TUD ידועים אינטראקציה עם arginines או lysines מפוגלים של פוליפפטידים אחרים 8-10.
בעבר, יש לנו שנוצרו קו דרוזופילה מהונדס המבטא HA-מתויג TUD הפונקציונלי 5 ולכן, נוגדן אנטי HA ספציפי משמש לניתץ מורכב TUD לאחר crosslinking.
בנוסף לcrosslinks חלבונים, פורמלדהיד יכול ליצור crosslinks חומצת חלבון גרעין, והוא משמש בניסויי שבב seq. יתר על כן, בדרוזופילה, in vivo crosslinking עם פורמלדהיד אפשר זיהוי של יעד RNA חלבון helicase Vasa RNA 11.
ואילו במאמר זה אנו מתארים שיטה לin vivo crosslinking ופורification של קומפלקסי חלבונים מעוברי דרוזופילה, שיטה זו יכולה להיות מותאמת לאורגניזמים וברקמות אחרים.
Protocol
Representative Results
Discussion
פורמלדהיד כבר בשימוש נפוץ כמגיב crosslinking לזיהוי חלבונים ואינטראקציות חומצת חלבון גרעין. חדירות טובות שלה מסיסות וקרום תא, יחד עם התאימות לנהלי ספקטרומטריית מסה במורד הזרם, להפוך פורמלדהיד סוכן מועמד אידיאלי עבור יישומי crosslinking תאיים 3,15-17. בפרט, הוא השתמש בהצלחה כ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לירדן דייוויס, Yanyan לין, אריק Schadler וJimiao ג'נג לעזרה הטכנית שלהם בעבודה זו. עבודה זו נתמכה על ידי NSF קריירה להעניק MCB-1054962 לALA
Materials
| Drosophila agar | Lab Scientific (http://www.labscientific.com/) | FLY-8020-1 | Do not autoclave the water and agar mix for prolonged period of time as it will cause the apple juice plates to become fragile |
| Methyl 4-hydroxybenzoate | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | H5501 | Other name: TEGOSEPT |
| Population cage | Flystuff (http://www.flystuff.com/) | 59-104 | |
| Fine nylon mesh | Flystuff (http://www.flystuff.com/) | 57-102 | When making the collection basket, cut the mesh slightly larger than the opening of the falcon tube cap to ensure a tight seal |
| Dounce homogenizer | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | D8938-1SET | Chill the homogenizer on ice and prerinse with cold lysis buffer before use to prevent protein degradation |
| Protease inhibitor cocktail | Roche (http://www.rocheusa.com/portal/usa) | 4693132001 | PBS could be used to prepare concentrated protease inhibitor stock solution |
| Anti-HA agarose beads | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | The kit also includes HA-peptide and spin columns |
| HA-peptide | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | Prepare to 2 mg/ml with PBS |
| Spin Column | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | Spin columns are included as part of the kit |
| Isopropanol | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP26324 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP151-500 | |
| Heptane | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | H350-4 | |
| PBS | Invitrogen (https://www.lifetechnologies.com/us/en/home.html) | AM9625 | Dilute from 10 X to 1 X with nanopure water before use |
| Formaldehyde | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP531-500 | |
| Glycine | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0724 | |
| SDS | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0301 | |
| Urea | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0730 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | P7626-1G | Prepare 200 mM stock solution in isopropanol then dilute to working concentration of 2 mM in lysis buffer |
| IGEPAL CA-630 | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | I8896-50ML | |
| Tween 20 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP337-100 | |
| 15-ml tubes | USA Scientific (http://www.usascientific.com/) | 1475-0511 | |
| Bleach | Clorox brand | Dilute with equal volume of nanopure water to make 50% bleach | |
| 50-ml tubes | BD Biosciences (http://www.bdbiosciences.com/home.jsp) | 352098 | |
| Top layer sieve | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | 04-884-1AK | |
| Bottom layer sieve | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | 04-884-1BA |
References
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome research. 22, 1813-1831 (2012).
- Murigneux, V., Sauliere, J., Roest Crollius, H., Le Hir, H. Transcriptome-wide identification of RNA binding sites by CLIP-seq. Methods. , (2013).
- Sutherland, B. W., Toews, J., Kast, J. Utility of formaldehyde cross-linking and mass spectrometry in the study of protein-protein interactions. Journal of mass spectrometry : JMS. 43, 699-715 (2008).
- Creed, T. M., Loganathan, S. N., Varonin, D., Jackson, C. A., Arkov, A. L. Novel role of specific Tudor domains in Tudor-Aubergine protein complex assembly and distribution during Drosophila oogenesis. Biochemical and biophysical research communications. 402, 384-389 (2010).
- Arkov, A. L., Wang, J. Y., Ramos, A., Lehmann, R. The role of Tudor domains in germline development and polar granule architecture. Development. 133, 4053-4062 (2006).
- Boswell, R. E., Ptudor Mahowald, A. a gene required for assembly of the germ plasm in Drosophila melanogaster. Cell. 43, 97-104 (1985).
- Thomson, T., Lasko, P. Drosophila tudor is essential for polar granule assembly and pole cell specification, but not for posterior patterning. Genesis. 40, 164-170 (2004).
- Arkov, A. L., Ramos, A. Building RNA-protein granules: insight from the germline. Trends in cell biology. 20, 482-490 (2010).
- Gao, M., Arkov, A. L. Next generation organelles: Structure and role of germ granules in the germline. Molecular reproduction and development. , (2012).
- Liu, H., et al. Structural basis for methylarginine-dependent recognition of Aubergine by Tudor. Genes & development. 24, 1876-1881 (2010).
- Liu, N., Han, H., Lasko, P. Vasa promotes Drosophila germline stem cell differentiation by activating mei-P26 translation by directly interacting with a (U)-rich motif in its 3. UTR. Genes & development. 23, 2742-2752 (2009).
- Matthews, K. A., Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. A. Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Methods in Cell Biology. 44, 13-32 (1995).
- Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular cloning: A laboratory manual. , (2001).
- Thomson, T., Liu, N., Arkov, A., Lehmann, R., Lasko, P. Isolation of new polar granule components in Drosophila reveals P body and ER associated proteins. Mechanisms of development. 125, 865-873 (2008).
- Vasilescu, J., Guo, X., Kast, J. Identification of protein-protein interactions using in vivo cross-linking and mass spectrometry. Proteomics. 4, 3845-3854 (2004).
- Klockenbusch, C., Kast, J. Optimization of formaldehyde cross-linking for protein interaction analysis of non-tagged integrin beta1. J Biomed Biotechnol. 2010, 9275-9285 (2010).
- Nowak, D. E., Tian, B., Brasier, A. R. Two-step cross-linking method for identification of NF-kappaB gene network by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 39, 715-725 (2005).
- Zeng, P. Y., Vakoc, C. R., Chen, Z. C., Blobel, G. A., Berger, S. L. In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 41, 694 (2006).
- Liu, N., Dansereau, D. A., Lasko, P. Fat facets interacts with vasa in the Drosophila pole plasm and protects it from degradation. Current biology : CB. 13, 1905-1909 (2003).
