Uma In vivo A reticulação Abordagem para isolar Complexos de proteínas a partir de Drosophila Os embriões
Summary
Complexos de proteínas multi-componentes desempenham um papel crucial durante a função celular e desenvolvimento. Aqui, descrevemos um método usado para isolar complexos proteína nativa a partir de embriões de Drosophila após reticulação in vivo seguido de purificação dos complexos de ligações cruzadas para a subsequente análise da estrutura-função.
Abstract
Muitos processos celulares são controlados por complexos de proteína de múltiplas subunidades. Freqüentemente, esses complexos formam transitoriamente e exigem ambiente nativo de montar. Portanto, para identificar estes complexos proteicos funcionais, é importante para estabilizar in vivo antes da lise das células e purificação subsequente. Aqui nós descrevemos um método utilizado para isolar grandes complexos de proteínas de boa-fé a partir de embriões de Drosophila. Este método baseia-se na permeabilização embrião e estabilização dos complexos no interior dos embriões por reticulação in vivo, utilizando uma baixa concentração de formaldeído, o que pode facilmente atravessar a membrana celular. Subsequentemente, o complexo de proteína de interesse é imunopurificada seguido de purificação em gel e analisados por espectrometria de massa. Ilustraremos este método utilizando a purificação de uma proteína complexa Tudor, que é essencial para o desenvolvimento da linha germinativa. Tudor é uma grande proteína, que contém vários domínios Tudor – pequenomódulos que interagem com argininas metiladas ou lisinas de proteínas alvo. Este método pode ser adaptado para o isolamento de complexos de proteína nativa a partir de diferentes organismos e tecidos.
Introduction
Isolamento de conjuntos de proteínas de subunidades múltiplas e complexos de ADN ou ARN-proteína é realizada para identificar complexos proteicos, locus genómico reconhecidos pelas proteínas reguladoras de ligação de ADN ou de ARN alvos de proteínas de ligação a ARN. Diferentes métodos permitem a identificação do genoma de sites de DNA reconhecidos por fatores de transcrição ou proteínas da cromatina (Chip-seq) 1 e metas de RNA associadas a uma determinada proteína de ligação de RNA (CLIP-seq) 2. As bibliotecas do ADNc derivado de ARN-ou alvos de DNA são então profundamente sequenciado. Estes métodos utilizam química ou reticulação para estabilizar os complexos seguido por imunoprecipitação (IP), com um anticorpo contra um componente proteico do complexo estudado induzida por UV.
Durante o desenvolvimento de um organismo, muitos complexos de proteínas formam transitoriamente. Portanto, é essencial analisar a composição e função dos complexos in vivo para compreender os mecanismos moleculares que controlam devolvimento. Tal análise in vivo seria superior à abordagem in vitro, uma vez que é virtualmente impossível reproduzir concentrações nativas dos componentes que interagem e ambiente bioquímico celular in vitro. Aqui demonstramos uma abordagem in vivo que utilizam com sucesso para isolar grandes complexos de proteínas a partir de embriões de Drosophila. Neste método, os complexos de proteína em embriões vivos são reticulados com um baixo teor de formaldeído e, subsequentemente, os complexos de proteína de interesse é isolado por IP com um anticorpo contra um componente conhecido dos complexos, seguida de purificação em gel dos complexos e análise de espectrometria de massa para identificar componentes complexos desconhecidos. Uma vez que o formaldeído é capaz de permear a membrana celular e possui um intervalo de reticulação de 2,3-2,7 Å 3, complexos de proteína, pode ser reticulado in vivo, e os componentes do complexo são susceptíveis de estar perto um do outro. Neste artigo,descrever este método usando o isolamento de Tudor (Tud) complexo de proteína como um exemplo. Tud é uma proteína da linha germinativa, que é essencial para o desenvolvimento da linha germinativa 4-7. Esta proteína contém 11 domínios TuD conhecidas por interagirem com argininas metiladas ou lisinas de outros polipeptídeos 8-10.
Anteriormente, têm gerado uma linha de Drosophila transgênica que expressa HA-marcado funcional Tud 5 e, portanto, o anticorpo anti-HA específico é utilizado para puxar para baixo complexo Tud após reticulação.
Em adição a ligações cruzadas de proteína-proteína, o formaldeído pode gerar ácido nucleico ligações cruzadas em proteína e é usado em experiências de ChIP-seq. Além disso, em Drosophila, in vivo, de ligação cruzada com formaldeído, permitiu a identificação de um alvo de ARN da proteína helicase vasa ARN 11.
Enquanto neste artigo descrevemos um método para a reticulação vivo e purificação de complexos de proteínas a partir de embriões de Drosophila, este método pode ser adaptado para outros organismos e os tecidos.
Protocol
Representative Results
Discussion
O formaldeído foi utilizada como um reagente de ligação cruzada para a identificação da proteína-proteína e interacções proteína-ácido nucleico. A sua boa solubilidade e permeabilidade da membrana da célula, juntamente com a compatibilidade com os procedimentos de espectrometria de massa a jusante, fazer formaldeído um agente candidato ideal para aplicações de reticulação intracelulares 3,15-17. Em particular, foi utilizado com sucesso para identificar mRNAs associados com vasa, uma helicase …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Jordan Davis, Yanyan Lin, Eric Schadler e Jimiao Zheng por sua ajuda técnica com este estudo. Este trabalho foi financiado pela NSF CARREIRA conceder MCB-1054962 para ALA
Materials
| Drosophila agar | Lab Scientific (http://www.labscientific.com/) | FLY-8020-1 | Do not autoclave the water and agar mix for prolonged period of time as it will cause the apple juice plates to become fragile |
| Methyl 4-hydroxybenzoate | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | H5501 | Other name: TEGOSEPT |
| Population cage | Flystuff (http://www.flystuff.com/) | 59-104 | |
| Fine nylon mesh | Flystuff (http://www.flystuff.com/) | 57-102 | When making the collection basket, cut the mesh slightly larger than the opening of the falcon tube cap to ensure a tight seal |
| Dounce homogenizer | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | D8938-1SET | Chill the homogenizer on ice and prerinse with cold lysis buffer before use to prevent protein degradation |
| Protease inhibitor cocktail | Roche (http://www.rocheusa.com/portal/usa) | 4693132001 | PBS could be used to prepare concentrated protease inhibitor stock solution |
| Anti-HA agarose beads | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | The kit also includes HA-peptide and spin columns |
| HA-peptide | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | Prepare to 2 mg/ml with PBS |
| Spin Column | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | Spin columns are included as part of the kit |
| Isopropanol | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP26324 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP151-500 | |
| Heptane | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | H350-4 | |
| PBS | Invitrogen (https://www.lifetechnologies.com/us/en/home.html) | AM9625 | Dilute from 10 X to 1 X with nanopure water before use |
| Formaldehyde | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP531-500 | |
| Glycine | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0724 | |
| SDS | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0301 | |
| Urea | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0730 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | P7626-1G | Prepare 200 mM stock solution in isopropanol then dilute to working concentration of 2 mM in lysis buffer |
| IGEPAL CA-630 | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | I8896-50ML | |
| Tween 20 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP337-100 | |
| 15-ml tubes | USA Scientific (http://www.usascientific.com/) | 1475-0511 | |
| Bleach | Clorox brand | Dilute with equal volume of nanopure water to make 50% bleach | |
| 50-ml tubes | BD Biosciences (http://www.bdbiosciences.com/home.jsp) | 352098 | |
| Top layer sieve | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | 04-884-1AK | |
| Bottom layer sieve | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | 04-884-1BA |
References
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