세포 외 기질은 상처 치유, 염증과 종양 발생시 상당한 개조를 겪는다. 우리는 섬유의 역학뿐만 아니라 표면 형광 또는 이광자 현미경을 사용하여 높은 공간 및 시간 해상도를 가진 메쉬 형상의 매트릭스 성분을 시각화하는 신규의 intravital 면역 형광 현미경 방식을 제시한다.
조직 형태를 유지하기 위해 물리적 지지체되는 외에, 세포 외 기질 (ECM)가 활발히 개발과 기관의 항상성 동안 세포 및 조직 기능 조절에 관여한다. 그것은, 생리 활성 ECM 단백질 조각의 출시를 통해 같은 생화학 생체 역학 및 생물 물리학 적 신호 전달 경로를 통해 작용하는 조직의 장력을 조절하고, 세포의 이동에 대한 경로를 제공함으로써 그렇게한다. 종양 미세 환경의 세포 외 기질을 분해, 증착 및 원 섬유 및 비 섬유 성 기질 단백질의 조직을 특징으로 상당한 개조를 겪는다. 종양 미세 환경의 기질 보강은 종양의 성장과 침윤을 촉진하고, 혈액과 림프 혈관의 리모델링을 일으킬 수 있습니다. 기질 단백질의 라이브 영상은, 그러나,이 점에 매트릭스 성분의 대다수 L 떠나는 다 광자 현미경을 사용하여 제 고조파 발생에 의해 검출 될 수있는 섬유 성 콜라겐에 한정argely 보이지 않는. 여기에서 우리는 세포 외 기질 단백질과 표면 형광 및 두 광자 현미경을 사용하여 살아있는 생쥐에 노출 된 조직의 intravital 이미징의 immunolabeling, 얇은 지느러미 귀 피부 종양 접종에 대한 절차를 설명합니다. 우리의 intravital 촬상 방법은 성장하는 피부 종양의 맥락에서 원 섬유 및 비 – 섬유 성 매트릭스 단백질 양의 직접 검출을 허용한다. 우리는 지역의 매트릭스 수축에 의한 혈관 리모델링의 예를 보여줍니다. 우리는 또한 두 번째 고조파 발생 검출 종양 섬유 성 매트릭스 우리는 또한 종양 세포 및 종양 세포와 T-세포 상호 작용의 장기간 (13 시간) 이미징을 보여 그러한 테나의 C.로서 새롭게 증착 행렬 요소로부터 공간적으로 구별되는 것으로 발견 기저막의 콜라겐 IV를 따라 이동. 종합적으로,이 방법은 고유 수 prov 수도 종양 세포의 동시 검출, 물리적 미세 시간 이상의 내인성 조직 면역 반응을 허용종양의 진행 및 궁극적 인 성공 또는 치료에 저항을 기본 메커니즘에 IDE 중요한 통찰력.
염증, 전이 행렬 리모델링 과정의 intravital 이미징 연구의 중요한 영역이다 형광 단백질 1,2을 표현하는 다수의 유전자 변형 기자의 마우스 모델을 만드는 동기를 부여하고있다. 인해 이미지 품질을 감소시키고 제한 조직을 통해 침투 빛 포커스 아웃 형광 신호에, 촬상 두꺼운 티슈는 공 초점 또는 다중 광자 주사 현미경 3 가능. 빠른을 사용하여 저렴하고 복잡한 표면 형광 현미경은 같은 닭 리오 – 뇨 막 (4) 또는 마우스 귀 진피 5로 거의 2 차원의 조직이 가능합니다. 대부분의 이미징 시스템은 세포 유형 특정 방식으로 다양한 형광 단백질을 발현하는 형질 전환 마우스를 활용. 이들 단백질이 약한 광독성을 제공하더라도, 이들은 면역 반응 6을 유도한다. 더욱이, 특정 세포 아형 전환하거나 표 어렵다이러한 변화에 따라 IR의 기초 또는 활성화 된 상태는 새로운 유전 모델의 준비가 필요합니다. 형광 단백질의 발현은 일반적으로 세포 내 구획으로 제한 될 때 또, 통상 기저막 단백질 또는 조직 케모카인 예금 7 같은 화상 세포 구조하는 것은 불가능하다. 대신, 세포 항원에 대한 항체를 간접 표시는 거의 모든 세포 형 또는 매트릭스 특정 구성 요소 8,9를위한 유연성을 제공합니다. 그러나,이 라벨 방식의 가장 큰 단점은 보완 시스템에 의존 세포 독성 및 세포와 세포 외 구조 (10)의 식균 작용을 트리거 할 수있는 항원 – 항체 면역 복합체에 의해 매개되는 면역 독성과 관련이 있습니다.
염증이나 상처 치유 동안 세포 종양 미세 환경의 매트릭스뿐만 아니라 정상 조직으로는 상당한 개조를 겪는다. 종양 미세 환경의 기질 보강은 프로모션 할 수스트레스로 인해 유발 신호 전달 메커니즘과 혈액과 림프 혈관 (11)의 원인이 리모델링에 테 종양의 성장과 침략. 그러나, 매트릭스 단백질의 라이브 영상은 다중 광자 현미경을 사용하여 제 고조파 발생에 의해 검출 될 수있는 섬유 성 콜라겐에 한정된다. 최근 우리는 묘화 세포 및 조직 구조 (5)에 광 및 면역 독성 손상의 위험을 최소화하는 신규의 intravital 촬상 방법을 발표 하였다. 연속의 intravital 시각화 한 라운드 2 시간 12-17 30 분의 범위이다 설립 이미징 기술과 비교하면, 우리의 intravital 면역 형광 (IF) 기술은 12 시간 (장기 8) 촬상 허용. 이는 촬상 시간은 우리 동물 프로토콜에 정의 된 한계로 인해 12 시간 제한 만 연장 될 수 없다는 기술적 이의 징후가 없다는 것을 유의하는 것이 중요하면 혈압과 심장 같은 동물의 임계 상태 변수,환율 8을 제어합니다. 또한, 자동화 된 형광 실체 현미경을 이용하여, 우리는 하나의 실험 기간 동안 다수의 분야에서 이미지를 수집 할 수 있었다 기능적 혈액 및 림프관에 의해 지원 피부의 생리 컨텍스트에서 발생한 희귀 면역 및 리모델링 과정을 관찰했다. stereomicroscopic 렌즈는 비교적 큰, 2cm의 작동 거리를 가지며 이광자 현미경 광학 대조적 수침 기화 필요로하지 않기 때문에, 장기간의 촬상은 형광 실체 현미경을 이용하여 수행 하였다. 의 intravital IF는 정상적인 피부의 세포 외 기질 성분의 면역 표지 및 검출을 허용했다. 이 기술의 디자인은 유해 immunotoxic 효과에게 5를 유발하지 않고 살아있는 세포 및 수술 노출 된 마우스 진피에 조직 매트릭스 요소에 대한 면역 염색을 사용하는 혁신적인 개념을 기반으로합니다. 수술 자체가 진피에 안전그것은 단지 독립적으로 자율적으로 혈액에 의해 공급 및 별도의 림프 순환에 의해 배수, 신경 지배하는 귀에 두 개의 피부 층의 분리에 의존로 혈관. 우리의 실험 장치는 허용 혈액과 림프 혈관과 상처 치유 과정과 백혈구의 인신 매매를 포함하여 최소 12 시간 이상 중요한 병리 생리 학적 이벤트의 범위의 영상. 해당 출판물, 우리는의 intravital 이미징의 다양한 분야에서 최첨단의 기준에 우리의 기술을 비교했다. 결과적으로, 우리는 초기 림프관 15수록 대신 예상들이 면역 세포의 고유 시각화 백혈구 등의 다양한 유형에 의해 혈관 외 유출 및 림프 intravasation 이벤트를 관찰했다. 또한, 다른 그룹 9,18 수행 관찰을 보완, 우리는 생체 CCL21의 수집에 있지만 자주 초기 림프관에 강한 불연속 예금을 형성 할 수있는 것으로 나타났습니다.
<p c아가씨 = "jove_content은"> 여기에서 우리는 수정의 intravital을 설명 IF 두 번째 고조파 발생 (SHG)를 사용하여 섬유의 콜라겐의 네트워크를 감지하는 두 개의 광자 현미경과 결합 할 수있는 기술. 우리는이 방법은 또한 현재의 영상 기술 19로 크게 미개척는이다 테나의 C와 같은 매트릭스의 분자를 포함하는 동적 종양 미세 환경의 맥락에서 영상 암 세포의 침공에 사용될 수 있음을 보여준다. 우리는 종양의 섬유의 행렬은, 두 번째 고조파 발생 검출, 또한, 우리는 지역의 매트릭스 수축에 의한 혈관 리모델링의 예를 설명하는 긴 테나 C. 구성 새로 입금 매트릭스보다 종양 미세 환경의 서로 다른 위치를 차지하는 발견 종양 세포 기저막의 콜라겐 IV를 따라 종양 세포의 이동과 함께 T-세포 상호 작용의 기간 (13 시간) 촬상. 동시에 이러한 혈관 PE 등 지역 생리적 파라미터를 기록하는 동안 이러한 이벤트가 몇 군데 있습니다rmeability 및 림프 배수.의미
여기에서 우리는 높은 해상도와 섬유 성뿐만 아니라 메쉬와 같은 기질 단백질을 포함한 다양한 조직의 미세 환경 구성 요소의 동적 시각화 할 수있는 소설의 intravital 현미경의 접근 방식을 제시한다. (I)의 intravital 형광 이미징은 혈액이나 림프관에 용질 누설을 추적하기 위해, 예를 들면, 미세 혈관 연구에 사용되었지만, 면역 염색과 결합되지 않은 :이 방법은 현재의 intravital 이미징 기술에 비해 몇 가지 장점을 가지고있다. (II) 유전자 변형 기자 마우스의 사용은 이미지에 표시 할 특정 세포 유형은 가능하지만, 자신의 가용성 (또는 새로 작성하는 상당한 노력을) 필요로하고 연구 할 수있는 종류의 세포 상호 작용의 수를 제한합니다. (ⅲ) 세포 외 기질은 초 고조파 발생을 이용하여 생체 내 이미징 될 수 있지만,이 기술은 단지 중요한 세포 외 다수의 부품을 떠나는, 콜라겐 섬유를 검출 할 수있다기저막, fibronectins, tenascins, 성장 인자, 케모카인 및 현재의 연구의 손이 닿지 않는 조직 글리코 사 미노 글리 칸 등. 우리의 방법은 이러한 한계를 극복하고, 표준 영상 기법은 성장 인자 (예 : VEGF 26) 및 케모카인 (CCL21 5,18 및도. 2D 바인딩 다른 세포 유형, 조직 구조, 헤파린 설페이트의 예금 immunostainings 혼입 더욱 결합 될 수있게 ) 또는 세포 외 기질 단백질을 동시에 혈액 및 / 또는 림프 흐름을 추적하면서.
제한
의 intravital IF의 표면 형광 이미징은 두꺼운 피하 조직 (지방 조직)의 박탈 얇은 피부 플랩, 제한됩니다. 우리는 지느러미 귀 진피는 기술이 귀 진피에 한정되지 않고, 경우의 intravital과 귀, 피부, 표면 형광 상대적으로 무해한 수술 박람회에 최적입니다 잠재적 예에 적용 할 수있는 것으로 나타났습니다 있지만발가락 또는 신생아 마우스의 뒷면 피부의 노출 된 피부. 면역의 급속한 항체 염색 (15 분) 경우는 수동 확산에 의존하는 것이 아니라 기능적인 림프 배수 및 간질 유체의 흐름을 필요로 림프 혈관이 27 폐색하는 경우, 따라서 전혀 오염이 관찰 될 수있다. 그와 일치하여, 림프 혈관이 강한 후 새는 혈액 혈관 (부상 혈관, 동맥) 5 얼룩. 지느러미와 복부 귀 피부 플랩의 분리는 가벼운 수술이지만 다양한 조직 세포에 약간의 모세 혈관과 세포 죽음에 부상의 원인이됩니다. 하나의 예를 들면 세포의 생존에 대한 약물의 온화한 효과를보고 완전히 손상 조직을 조사 할 필요가있을 때이 문제가 될 수 있습니다. 또한 광독성 및 광표백으로부터 피부를 보호하는 역할을 항산화 애플리케이션 티슈 산화 스트레스 또는 산화 질소 biolog 예 공부의 intravital 면역 형광 기법의 사용을 배제예.
마지막으로, 면역 복합체와 조직 상주 식세포의 눈을 멀게하는 것은이 세포와 조직 면역 반응 및 수지상 세포 활성화의 연구 예를 들어 영향을 활성화 할 수 있습니다.
수정 및 문제 해결
티슈 산화 스트레스 또는 산화 질소 생물학을 연구하기 위하여, 아스 코르 베이트는 실험 출력을 방해하지 않는 다른 조직 호환 매체로 대체되어야한다. 연구의 목적은 기능 및 조직 면역 반응 및 수상 세포의 활성화 및 이동의 활성화 경우에 마찬가지로, 경피 면역 세포에 차단 된 Fc 수용체는 피해야한다. 이것은 (F (AB) 2 항체 단편) 또는 검출 시약으로서 바이오틴 항체 및 스트렙 타비 딘의 형광 사용 절단 Fc 단편과 차 항체를 이용하여 수행 될 수있다.
미래의 응용 프로그램
우리는 소설과 독특한 내부를 제시중요한 IF 두 광자 현미경을 사용하여 SHG 감지 섬유의 성숙 콜라겐과 함께 이식 가능한 피부 종양의 세포 외 기질 (extracellular matrix)의 이미지가 아닌 섬유의 구성 요소에 대한 기술. 표면 형광 이미징 위에 다중 광자 (또는 공 초점) 현미경을 사용하는 장점 중 하나는 Z-스태킹 가능하고있는 결과 세포 외 매트릭스 내에서 발생하는 이벤트의 공동 지역화 공간적, 림프계 또는 혈관으로 예 종양 intravasation 그중 경우 표준 표면 형광 현미경은 침입 세포의 형태 학적 변화에서 유추 할 수있다. 이 기술은 훨씬 더 넓은 가능성이있다. 림프 별 광 역학 치료 (photodynamic therapy)가 27만큼 림프 폐색의 메커니즘을 조사하기 위해 예를 들어, 우리의 intravital를 사용했습니다. 이 방법의 추가 잠재적 인 응용 프로그램을 포함하지만, 이식 거부 또는 혈액과 림프의 방법의 염증 메커니즘 동안 피부 면역의 조사에 국한되지 않습니다 종양 동안 ATIC의 혈관의 성장.
절차의 중요한 단계
생리적 조직 환경을 유지하기위한 중요한 의미를 가지고 가장 중요한 단계는 등의 진피에서 복부 피부와 연골 수술 분리합니다. 절단 또는 주요 동맥 또는 정맥 폐색하는 치료와 세포의 움직임 8 세포 반응에 영향을 미칠 것이다, 과도한 출혈과 지역 조직의 저산소증으로 이어질 것입니다. 수술 접착제로 귀를 고정화하는 것은 조직을 노출에 접착제를 흘리고주의하여 수행해야 혈관의 폐색에 의해 조직에 영구적 인 손상의 원인이됩니다. 마우스의 온도는 37 ℃로 조절하고 유지해야합니다 눈과 폐 제대로 실험 동안 가습 유지되도록 또한 가습 산소, 이소 플루 란 마취를 위해 사용되어야한다. 또한, 아스 코르 빈산 나트륨 갓 준비를해야하고 그 pH는 사용하기 전에 확인.
요약 ntent ">이의 intravital 면역 형광 마우스 피부에 복잡한 세포 사건의 분자 영상과 생리 기능의 실시간, 지역 측정 교량. 쉽게 후 개발 등의 연구에 적용 할 수있는 또한,이 방법은 큰 잠재력을 가지고 혈액과 림프 혈관 또는 유연성과 높은 처리량 잠재력. 다양한 병원체에 의해 피부 감염의 초기 단계를 시각화하는 메커니즘이의 intravital 기술은 크게 생물학의 여러 분야에 기여할 수있다.The authors have nothing to disclose.
저자는 이미지 처리에 도움 제레미 CM 테오와 S. 라이언 올리버 기여 및 졸 란타 Kilarska에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 두 개의 광자 현미경과 지원을 EPFL의 BIOP 핵심 시설 감사
이 작품은 유럽 연구위원회 (DC-림프, 206653-2), 유럽 Framework 프로젝트 7 (AngioScaff), 스위스 국립 과학 재단 (31-135756), 그리고 건강의 미국 국립 연구소에서 교부금에 의해 부분적으로 지원되었다 (NIH) / NIH 심장, 폐, 혈액 연구소 (NHLBI) (RO1 HL096539). 또한, 로버트 베너 수상 (스위스 암 리그)에서 자금 구입이 연구에 사용 된 라이카 실체 현미경 허용했다. 출자자는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 게시 할 수있는 의사 결정, 또는 원고의 준비에 역할을했다.
Mice Strain | |||
BALB/C mice (8-12 weeks ) | Charles River | Orleans,France | |
C57/Bl6 Mice (8-12 weeks ) | Harlan | Carshalton UK | |
Cell Line | |||
B16 F10 Melanoma expressing OVA-GFP | |||
Anesthesia Maintenance | |||
Isofluorane | Minrad Inc. | 2222 | Minrad Inc., Buffalo, NY |
Humidified delivery system | Rothhacher GmBH | Berne, Switzerland | |
DC Temperature Control System | FHC Inc | Bowdoin, MA | |
Stereomicroscope | |||
Fluorescence stereomicroscope with a motorized stage . | M250 FA, Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
1× lens (linear system magnification from 7.5× to 160×) | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
2× lens (linear system magnification from 15.6× to 320×) | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
DFC 350 FX camera controlled by LAS AF software | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
Multiphoton Microscopy | |||
LEICA SP5, two-photon multiplier, motorized stage | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
HCX APO 20x/1.2 oil immersion | |||
Chameleon Ultra Laser | |||
Reagents | |||
Ringer's buffer (102 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 28 mM sodium lactate) | B. Braun Medical AG | 445968 | Sempach, Germany |
Aprotinin | Elastin | AP92 | Owensville, MO |
Thrombin | Sigma-Aldrich | T7326-1KU | Taufkirchen, Germany |
Sodium ascorbate | Sigma-Aldrich | 11140-50G | Taufkirchen, Germany |
Mouse Serum raised against human IgG | Abcam | ab34834 | Cambridge, UK |
Collagen IV | Abcam | AB6581 | Cambridge, UK |
Perlacan | RnD | ab79465 | Minneapolis, MN |
Tenascin C | RnD | AF3358 | Minneapolis, MN |
Podoplanin | RnD | AF3244 | Minneapolis, MN |
LYVE-1 | Reliatech | 103-PA50 | Wolfenbüttel, Germany |
CCL21 | RnD | AF457 | Minneapolis, MN |
Streptavidin Pacific Blue | Invitrogen | S11222 | Grand Island, NY |
Streptavidin Alexa 647 | Invitrogen | S21374 | Grand Island, NY |
Streptavidin Alexa 488 | Invitrogen | S11223 | Grand Island, NY |
Donkey Anti Goat 594 | Invitrogen | A21113 | Grand Island, NY |
Donkey Anti Rabbit 594 | Invitrogen | A21207 | Grand Island, NY |
CMTPX CellTracker | Lifetechnologies | C34552 | Carlsbad, California |
Histocryl (surgical glue) | Braun Aesculap | 1050060 | Tuttlingen, Germany |
Cell Culture Reagents | |||
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM | Gibco Invitrogen | E15-843 | Grand Island, NY |
Fetal bovine serum (FBS | Gibco Invitrogen | Grand Island, NY | |
Trypsin | Gibco Invitrogen | 25300062 | Grand Island, NY |
PBS | Gibco Invitrogen | Grand Island, NY |