细胞外基质在伤口愈合,炎症和肿瘤发生实质性的重塑。我们提出了一个新颖的活体免疫荧光显微镜方法来可视化纤维状的网状基质成分使用落射荧光或双光子显微镜的高空间和时间分辨率的动态以及。
除了是一个物理支架,以维持组织形态,细胞外基质(ECM)积极参与制定和器官的动态平衡过程中调节细胞和组织的功能。它由通过生化,生物力学和生物物理信号传导途径,如通过作用的生物活性细胞外基质蛋白的片段的释放,调节组织张力,并提供途径的细胞迁移这样做。肿瘤微环境中的细胞外基质发生实质性重构,其特征在于,降解,沉积和组织纤维状和非纤维状基质蛋白。肿瘤微环境中的基质变硬可以促进肿瘤的生长和侵袭,并造成血液和淋巴血管重塑。基质蛋白的实时成像,但是,这点是有限的,可以通过产生二次谐波的使用多光子显微术来检测纤维状胶原,而使大多数基质组分的升argely无形。在这里,我们描述了在薄耳背侧皮肤肿瘤接种程序,免疫标记细胞外基质蛋白,并用萤光和双光子显微镜在活小鼠暴露组织的活体成像的。我们的活体成像方法允许直接检测两个纤维状和非纤维状基质蛋白中的一个生长的皮肤肿瘤的上下文。我们表明所引起的局部基质收缩血管重塑的例子。我们还发现,与二次谐波生成检测出的肿瘤的纤维状基质是由新沉积的基质组分如腱生蛋白C。我们还表明T细胞相互作用的长期(12小时)成像,肿瘤细胞和肿瘤细胞在空间上不同的沿着基底膜的IV型胶原的迁移。两者合计,该方法唯一允许同时检测肿瘤细胞,它们的物理和微环境随时间的内源性组织的免疫反应,其可以省IDE的重要见解相关肿瘤进展和最终的成功或抵抗治疗的机制。
炎症性,转移性和基质重塑过程的活体成像一直是一个重要的研究领域,并激发创造,表达荧光蛋白1,2众多记者的转基因小鼠模型。由于失焦荧光信号,从而降低图像质量和限制穿过组织轻微渗透,成像厚的组织是可能的,只有用共聚焦或多光子扫描显微镜3。使用更快,更昂贵和复杂的荧光显微镜可以仅与近二维组织如鸡绒毛膜尿囊膜4或小鼠耳真皮5。大多数成像系统采取的转基因小鼠的优势表达各种荧光蛋白的细胞类型特异性的方式。尽管这些蛋白报价弱势光毒性,它们诱导免疫应答6。此外,也难以特定细胞亚群之间切换或标记IR基或激活状态的这种变化需要新的遗传模型的制备。此外,作为荧光蛋白表达通常限于胞内区室,它通常是不可能像基底膜蛋白或组织趋化因子存款7图像胞外结构。相反,具有抗细胞外抗原的间接标记提供了灵活性,几乎所有的细胞类型或矩阵特定组件8,9。然而,这种标记方法的主要缺点是与免疫毒性通过抗原-抗体免疫复合物,可以触发补体系统依赖的细胞毒性和细胞与细胞外结构10介导的吞噬作用相关联。
肿瘤微环境中的炎症或创伤愈合过程中的细胞外基质的正常组织中,而且还发生实质性的重塑。肿瘤微环境中的基质变硬可以促销TE肿瘤的生长和侵袭,由于压力引起的信号传导机制及血液和淋巴管11的原因重塑。然而,基质蛋白的实时成像仅限于能够由二次谐波生成的使用多光子显微术来检测纤维状胶原。最近我们已经公布,最大限度地减少照片和免疫毒性损伤成像细胞和组织结构5的风险了一种新的活体成像的方法。在既定的成像技术,其中的单轮的连续活体可视化是在范围为30分钟至2小时12-17相比,我们的活体免疫荧光(IF)技术允许12小时(长期8)成像。值得注意的是,成像时间被限制到由于在我们的动物协议定义的限制12小时但没有任何技术反迹象表明,它不能长时间是非常重要的,如果动物的健康至关重要的参数,如血压和心脏率控制8。此外,通过使用自动化荧光显微镜,我们能够在一个单一实验中,收集从多个字段的图像,并观察到发生在由功能血液和淋巴管支持皮肤的生理上下文罕见的免疫和重塑的过程。由于显微立体透镜具有相对大的2厘米,工作距离和相对于双光子显微光学不需要汽化水浸泡,进行只在荧光立体显微镜长期成像。活体如果允许正常皮肤的任何细胞外基质成分的免疫标记和检测。这种技术的设计是基于使用免疫活细胞和手术暴露小鼠真皮组织基质元素,而不会造成有害的免疫毒性效应5的创新理念。在外科手术过程本身是安全的,真皮脉管系统,因为它只是依靠两个皮肤层中的独立支配,由血液输送自主和独立的淋巴环流倒掉耳朵的分离。我们的实验装置允许的范围内比至少为12小时,包括血液和淋巴管和伤口愈合过程之间白细胞运输重要病理生理事件的成像。在原始出版物,我们比较我们的技术,先进设备,最先进的活体成像的各个领域的标准。因此,我们通过不同类型的白细胞,包括进入收集,而不是预期的初始淋巴管15的免疫细胞的独特的可视化观察血管外渗和淋巴血管内的事件。此外,补充其他团体9,18所做的观察,我们发现, 在体内 CCL21能够形成于收集,但只有很少的初始淋巴管强,连续存款。
<p c小姑娘="“jove_content”">在这里,我们描述了一种改性活体IF的技术,可以用双光子显微镜进行组合,以检测使用二次谐波产生(SHG)纤维状胶原的网络。我们显示,也可以在动态肿瘤微环境,其中包括基质分子如腱生蛋白C,其是由当前的成像技术19基本上还未上下文用于成像癌细胞侵袭此方法。我们发现,肿瘤的纤维状基质,以产生二次谐波检测的,占据了肿瘤微环境中的不同位置较新沉积的基质腱生蛋白C的组成此外,我们描述了所引起的局部基质收缩血管重塑的例子中,长与肿瘤细胞和沿着基底膜IV型胶原的肿瘤细胞迁移的T细胞相互作用术语(12小时)成像。这些事件可以同时记录当地的生理参数,如血管PE成像rmeability和淋巴引流。意义
在这里,我们提出一种新的活体显微镜方法,使高分辨率和动态不同组织微环境的组件,包括纤维状以及网格状的基质蛋白的可视化。该方法具有过电流的活体成像技术几个优点:(ⅰ)活体荧光成像已被用于在微循环研究, 例如 ,以跟踪从血液或淋巴管进入溶质泄漏,但一直没有结合免疫染色。 (ⅱ)利用转基因报告小鼠的允许要被成像的特定细胞类型,但要求它们的可用性(或大量的努力以创建新的),并限制了该相互作用可以研究的细胞类型的数量。 (ⅲ)细胞外基质可在体内使用的二次谐波生成进行成像,但是这种技术只能检测纤维状胶原,留下了大量重要的细胞外成分如基底膜,纤连蛋白,tenascins,生长因子,趋化因子和组织粘多糖出目前的研究遥不可及。我们的方法克服了这些限制,并允许掺入标准成像技术,并进一步结合immunostainings为其他类型的细胞,组织结构,硫酸肝素的存款结合生长因子( 例如血管内皮生长因子26)和趋化因子(CCL21 5,18和图2D )或胞外基质蛋白,而同时跟踪血液和/或淋巴流。
限制
活体中频的落射荧光成像仅限于薄皮瓣,剥夺厚皮下组织(脂肪组织)的。而我们发现,背耳真皮是最优的耳部皮肤,落射荧光与活体的相对无害的外科论述中频技术不限于耳真皮和可能被应用到如脚趾或新生小鼠的背部皮肤裸露的皮肤。快速抗体染色(15分钟)在免疫荧光IF是不依赖于被动扩散,但需要有功能的淋巴引流和间质液流动,因此,如果淋巴管被封闭27无染色可以观察到。在与该行,淋巴管染色更强然后渗漏血液的血管(血管损伤,动脉)5。背侧和腹侧耳皮瓣的分离是一个温和的外科手术,但它会导致伤害一些毛细管和细胞死亡的各种组织细胞。这可能是一个问题,当一个需要探讨完全完整的组织, 例如在看药物对细胞存活的轻微影响。也抗氧化剂的应用是用于保护皮肤免受光毒性和光漂白排除了使用活体免疫荧光技术的研究,例如在组织的氧化应激或一氧化氮BIOLOG年。
最后,与免疫复合物致盲的居民组织的巨噬细胞可激活这些细胞,并影响如组织免疫反应和树突状细胞活化的研究。
修改和故障排除
为了研究组织的氧化应激或一氧化氮的生物,抗坏血酸,必须更换带不能与实验输出干扰其他组织相容的介质。类似地,应尽量避免挡住Fc受体上真皮的免疫细胞,如果研究的目的是函数和活化的组织的免疫反应和树突状细胞的活化和迁移。这可以通过使用二次抗体与Fc片段裂解(的F(ab)2抗体片段),或使用生物素化的抗体和链亲和素的荧光作为检测试剂来完成。
未来的应用
我们提出了一个新颖而独特的内重要中频技术细胞外基质中移植皮肤肿瘤中使用双光子显微镜SHG-检测纤维状和成熟的胶原相结合的图像非纤维状部件。一种利用多光子(或共焦)显微镜落射荧光过成像的优点为z-堆积的可能性,而由于空间的共定位外基质内发生的事件, 例如 ,肿瘤血管内进入淋巴管或血管,其中在的情况下标准荧光显微镜可以从入侵的细胞形态变化只能推断。该技术具有更加宽广的潜力。例如,我们已经使用了活体中频探讨淋巴管阻塞淋巴管特异性光动力疗法27的机制。另外的潜在这种方法的应用包括,但没有在移植排斥或血液和淋巴方法炎症,机制不限于皮肤免疫调查肿瘤发生过程中ATIC血管的生长。
在该过程的关键步骤
有对维持生理组织环境影响的关键最重要的一步是腹侧皮肤和软骨背侧真皮的手术分离。切断或阻塞的主要动脉或静脉会导致出血过多和局部组织缺氧,这将影响到治疗和细胞运动8细胞反应。固定手术胶耳应谨慎做作为溢出的胶水暴露组织会造成永久性的伤害组织由血管闭塞。鼠标的温度必须控制并保持在37℃。此外,加湿的氧气需要被用于异氟烷麻醉,使眼睛和肺停留在实验过程中适当地加湿。此外,抗坏血酸钠,必须新鲜配制,使用前其PH值检查。
ntent“>总之,这个活体免疫的桥梁生理功能与在小鼠皮肤复杂的细胞活动分子成像的实时,局部测量。此外,这种方法具有很大的潜力,因为它可以很容易地应用到如研究后发育血液和淋巴血管生成,或由各种病原体可视化皮肤感染的早期阶段。凭借其灵活性和高通量的潜在机制,这种活体技术可显著促进生物学的多个领域。The authors have nothing to disclose.
作者感谢杰里米CM张志贤和S.瑞安奥利弗的贡献和Jolanta Kilarska在图像处理有帮助。我们感谢在洛桑联邦理工学院的BIOP核心设施与双光子显微镜的支持
这项工作是由欧洲研究委员会(DC-淋巴,206653-2),欧洲框架项目7(AngioScaff),瑞士国家科学基金会(31-135756),和健康的美国国家研究院的赞助支持部分(NIH)/美国国立卫生研究院心脏,肺和血液研究所(NHLBI)(RO1 HL096539)。此外,从罗伯特·温纳奖(瑞士癌症联盟)资金允许购买在这项研究中所使用的徕卡立体显微镜。资助者在研究设计,数据收集和分析,发布的决定,或准备稿子没有任何作用。
Mice Strain | |||
BALB/C mice (8-12 weeks ) | Charles River | Orleans,France | |
C57/Bl6 Mice (8-12 weeks ) | Harlan | Carshalton UK | |
Cell Line | |||
B16 F10 Melanoma expressing OVA-GFP | |||
Anesthesia Maintenance | |||
Isofluorane | Minrad Inc. | 2222 | Minrad Inc., Buffalo, NY |
Humidified delivery system | Rothhacher GmBH | Berne, Switzerland | |
DC Temperature Control System | FHC Inc | Bowdoin, MA | |
Stereomicroscope | |||
Fluorescence stereomicroscope with a motorized stage . | M250 FA, Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
1× lens (linear system magnification from 7.5× to 160×) | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
2× lens (linear system magnification from 15.6× to 320×) | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
DFC 350 FX camera controlled by LAS AF software | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
Multiphoton Microscopy | |||
LEICA SP5, two-photon multiplier, motorized stage | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
HCX APO 20x/1.2 oil immersion | |||
Chameleon Ultra Laser | |||
Reagents | |||
Ringer's buffer (102 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 28 mM sodium lactate) | B. Braun Medical AG | 445968 | Sempach, Germany |
Aprotinin | Elastin | AP92 | Owensville, MO |
Thrombin | Sigma-Aldrich | T7326-1KU | Taufkirchen, Germany |
Sodium ascorbate | Sigma-Aldrich | 11140-50G | Taufkirchen, Germany |
Mouse Serum raised against human IgG | Abcam | ab34834 | Cambridge, UK |
Collagen IV | Abcam | AB6581 | Cambridge, UK |
Perlacan | RnD | ab79465 | Minneapolis, MN |
Tenascin C | RnD | AF3358 | Minneapolis, MN |
Podoplanin | RnD | AF3244 | Minneapolis, MN |
LYVE-1 | Reliatech | 103-PA50 | Wolfenbüttel, Germany |
CCL21 | RnD | AF457 | Minneapolis, MN |
Streptavidin Pacific Blue | Invitrogen | S11222 | Grand Island, NY |
Streptavidin Alexa 647 | Invitrogen | S21374 | Grand Island, NY |
Streptavidin Alexa 488 | Invitrogen | S11223 | Grand Island, NY |
Donkey Anti Goat 594 | Invitrogen | A21113 | Grand Island, NY |
Donkey Anti Rabbit 594 | Invitrogen | A21207 | Grand Island, NY |
CMTPX CellTracker | Lifetechnologies | C34552 | Carlsbad, California |
Histocryl (surgical glue) | Braun Aesculap | 1050060 | Tuttlingen, Germany |
Cell Culture Reagents | |||
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM | Gibco Invitrogen | E15-843 | Grand Island, NY |
Fetal bovine serum (FBS | Gibco Invitrogen | Grand Island, NY | |
Trypsin | Gibco Invitrogen | 25300062 | Grand Island, NY |
PBS | Gibco Invitrogen | Grand Island, NY |