Внеклеточный матрикс подвергается существенной ремоделирования во время заживления ран, воспаления и опухолей. Мы представляем новый прижизненный подход иммунофлюоресценции микроскопии для визуализации динамику фибриллярных а также сетки, как компоненты матрицы с высоким пространственным и временным разрешением, используя эпифлуоресцентной или двухфотонного микроскопа.
Помимо того, что физическая леса для поддержания тканей морфологию, внеклеточный матрикс (ECM) активно участвует в регуляции функции клеток и тканей в процессе разработки и органов гомеостаза. Он делает это, выступая в через биохимических, биомеханических, и биофизических сигнальных путей, например, через освобождение биологически активных фрагментов ECM белка, регулирующего ткани напряженности и обеспечение пути для миграции клеток. Внеклеточный матрикс из микросреды опухоли подвергается существенной ремоделирования, характеризующийся деградации, осаждения и организации фибриллярных и не фибриллярных белков матрикса. Стромальный ужесточение микросреды опухоли может способствовать росту опухоли и инвазии, и вызвать ремоделирования кровеносных и лимфатических сосудов. Живая съемка матричных протеинов, однако, на данный момент ограничивается фибриллярных коллагенов, которые могут быть обнаружены с помощью генерации второй гармоники с помощью нескольких фотонов микроскопии, оставляя большую часть компонентов матрицы лargely невидимым. Здесь мы описываем процедуры инокуляции опухоли в тонкой спинного уха кожи, иммунного белков внеклеточного матрикса и прижизненной визуализации открытой ткани в живых мышей с использованием эпифлуоресцентной и двухфотонного микроскопии. Наша прижизненный метод визуализации позволяет для прямого обнаружения как фибриллярных и матричных протеинов без фибриллярных в контексте растущей опухоли кожной. Мы показываем примеры реконструкции сосудов, вызванные местной сокращения матрицы. Мы также обнаружили, что фибриллярная матрица опухоли обнаружены с генерации второй гармоники пространственно отличие от недавно депонированных матричных компонентов, таких как тенасцина С. Мы также показали долгосрочные (12 часов) визуализации взаимодействия Т-клеток с опухолевыми клетками и опухолевых клеток миграция вдоль коллагена IV базальной мембраны. Взятые вместе, этот метод позволяет однозначно для одновременного обнаружения опухолевых клеток, их физического микросреды и эндогенного иммунного ответа ткани с течением времени, что может провязь важную информацию о механизмах, лежащих в основе прогрессии опухоли и конечный успех или устойчивость к терапии.
Прижизненной визуализации воспалительных, метастатических и матричных процессах ремоделирования была важной областью исследований и побудило создание многочисленных трансгенных мышиных моделях репортеров, которые выражают флуоресцентные белки 1,2. Из-за из фокуса флуоресцентных сигналов, которые снижают качество изображения и пределы проникновения света через ткань, изображения толщиной ткани возможно только с конфокальной или сканирования многофотонное микроскопии 3. Использование быстрее, менее дорогим и сложным эпифлуоресцентная микроскопии возможно только с почти двумерных тканей, таких как курица CHORIO-аллантоисной мембраны 4 или мыши уха дермы 5. Большинство систем визуализации воспользоваться трансгенных мышей, экспрессирующих различные флуоресцентные белки в зависимости от конкретного типа моды клеток. Даже если эти белки предложить слабый фототоксичность, они индуцируют иммунный ответ 6. Кроме того, трудно для переключения между специфических клеток подтипов или пометитьИК базальная или активированные государства как такого изменения требует подготовки нового генетической модели. Кроме того, как выражение флуоресцентный белок обычно ограничивается внутриклеточное пространство, обычно не представляется возможным изображения внеклеточных структур, таких как подвал мембранных белков или тканей хемокинов отложений 7. Вместо этого, косвенное маркировка с антителами против внеклеточных антигенов обеспечивает гибкость для практически любого камерного типа или матрицы конкретного компонента 8,9. Однако главным недостатком этого подхода маркировки связано с иммунотоксичности опосредованного антиген-антитело иммунных комплексов, которые могут вызвать Система комплемента в зависимости от токсичности клеток и фагоцитоз клеток и внеклеточных структур 10.
Внеклеточный матрикс из микросреды опухоли, но и нормальной ткани при воспалении или заживления ран, претерпевает существенную модернизацию. Стромальный ужесточение микросреды опухоли может промоТе рост и инвазия опухоли из-за стресс-индуцированных сигнальных механизмов и причин ремоделирования кровеносных и лимфатических сосудов 11. Тем не менее, жить изображений матричных белков ограничивается фибриллярных коллагенов, которые могут быть обнаружены с помощью генерации второй гармоники с помощью нескольких фотонов микроскопии. Недавно мы опубликовали новый прижизненный метод визуализации, которая сводит к минимуму риск фото-и иммуно-токсического повреждения отображаемого клеток и тканевых структур 5. По сравнению с установленными методов визуализации, где один раунд непрерывной прижизненной визуализации находится в диапазоне от 30 минут до 2 часов 12-17, наша прижизненный иммунофлюоресценции (ИФ) методика позволила 12 часов (долгосрочные 8) изображений. Важно отметить, что время визуализации ограничена до 12 часов из-за пределов, определенных в нашем протоколе животных, но нет никаких технических противопоказания, что он не может быть продлен, если критические параметры для здоровья животного, как кровяное давление и сердцеСкорость контролируется 8. Кроме того, с помощью автоматизированной флуоресценции стереомикроскоп мы смогли собрать изображения с нескольких полей во время одного эксперимента и наблюдали редкие иммунологические и реконструкции процессов, происходивших в физиологическом контексте кожи, поддерживаемой функциональной кровеносных и лимфатических сосудов. Поскольку stereomicroscopic линза имеет относительно большой, 2 см, рабочее расстояние и в отличие от двухфотонных микроскопических оптики не требует испарения воды погружение, долговременные изображений была выполнена только под флуоресцентным стереомикроскопа. Прижизненные если это разрешено иммунную маркировки и обнаружения любого внеклеточного матрикса составляющей нормальной кожи. Конструкция этой техники основано на инновационной концепции использования иммуноокрашивания для живых клеток и матричных ткани элементов на хирургическим подверженных дермы мыши, не вызывая вредные иммунотоксичном воздействии 5. Сама хирургическая процедура является безопасной в дермусосудистую, поскольку основывается только на принципе разделения двух слоев кожи в ухе, которые независимо иннервируются, автономно питается кровью и осушенных отдельными лимфатических тиражами. Наша экспериментальная установка позволяет изображений из ряда важных патофизиологических событий более не менее 12 часов, включая торговлю лейкоцитов между кровеносных и лимфатических сосудов и заживление ран процессов. В оригинальной публикации, мы сравнили нашу технику, чтобы государством в самых современных стандартов в различных областях прижизненной визуализации. Следовательно, мы наблюдали крови экстравазации сосудов и лимфатические события intravasation различными типами лейкоцитов, в том числе уникальной визуализации иммунных клеток, поступающих сбора вместо ожидаемого начальные лимфатические сосуды 15. Кроме того, дополняя наблюдения, выполненные другими группами 9,18, мы обнаружили, что в естественных условиях CCL21 способен образовывать сильные, разрывные отложений на сбор, но лишь изредка на начальных лимфатические сосуды.
<p cдевушка = "jove_content"> Здесь мы опишем модифицированную прижизненной ЕСЛИ техника, которая может сочетаться с двухфотонного микроскопии для обнаружения сеть фибриллярных коллагенов использованием генерации второй гармоники (ГВГ). Показано, что этот метод также может быть использован для инвазии раковых клеток изображения в контексте динамического микроокружения опухоли, который включает молекулы матрикса, такие как тенасцину C, которые в значительной степени неисследованным текущими методов визуализации 19. Мы обнаружили, что фибриллярная матрица опухоли, обнаружены с генерации второй гармоники, занимает различные местоположения опухоли микроокружения, чем недавно нанесенной матрицы, составленной из тенасцина С. Кроме того, мы опишем примеры реконструкции сосудов, вызванные местной сокращения матрицы, долго- Термин (12 часов) визуализации Т-клеточных взаимодействий с опухолевых клеток и опухолевых клеток миграции вдоль коллагена IV базальной мембраны. Такие события могут быть отображены одновременно записывая местные физиологических параметров, таких как ре кровеносных сосудовrmeability и лимфодренаж.Значение
Здесь мы представляем новый прижизненный микроскопии подход, позволяющий с высоким разрешением и динамической визуализации различных компонентов тканей микроокружения, в том числе фибриллярных а также сетки, как матричных протеинов. Этот метод имеет несколько преимуществ по сравнению с текущими прижизненных методов визуализации: (я) Прижизненные изображения флуоресценции был использован в микроциркуляции исследований, например, для отслеживания утечки растворенного вещества из крови или в лимфатические сосуды, но не было в сочетании с иммунной окраски. (II) Использование генетически модифицированных репортер мышей позволяет для конкретных типов клеток для включения в образ, но требуется их наличие (или значительные усилия для создания новых) и ограничивает количество взаимодействующих типы клеток, которые могут быть изучены. (III) Внеклеточный матрикс могут быть отображены в естественных условиях с использованием генерации второй гармоники, но эта методика может только обнаружить волокнистых коллагены, в результате чего большое количество важных компонентов внеклеточноготаких как базальных мембран, фибронектины, tenascins, факторы роста, хемокинов и ткани гликозаминогликанов вне досягаемости для современных исследований. Наш метод позволяет преодолеть эти ограничения, и позволяет стандартные методы визуализации, которые будут включены и далее в сочетании с immunostainings для других типов клеток, тканевых структур, месторождений гепаринсульфат связывания факторов роста (например, VEGF 26) и хемокинов (CCL-21 5,18 и рис. 2D ), или белки внеклеточного матрикса и одновременно отслеживания крови и / или лимфатические потоков.
Недостатки
Эпифлуоресцентная визуализации прижизненной IF ограничивается тонких кожных лоскутов, лишенных толщиной подкожного слоя (жировой ткани). В то время как мы обнаружили, что спинной уха дермы является оптимальным для относительно безвредны хирургического экспозиции кожи уха, эпифлуоресцентной с прижизненный IF методика не ограничивается уха дермы и потенциально могут быть применены к напроткрытые участки кожи из ног или задней коже новорожденного мыши. Быстрое окрашивание антителом (15 минут) в иммунофлюоресценции ЕСЛИ не зависит от пассивной диффузии, но требует функциональной лимфодренаж и интерстициальный поток жидкости, следовательно, нет окрашивание не может наблюдаться, если лимфатические сосуды поглощаются 27. В соответствии с этим, лимфатические сосуды пятно сильнее вытекающей сосудистую крови (поврежденные сосуды, артериол) 5. Разделение спинной и брюшной ушанке кожи является мягким хирургическая процедура, но это вызывает повреждение некоторых капилляров и гибели клеток в различные клетки тканей. Это может быть проблемой, когда нужно исследовать полностью неповрежденной ткани, например, глядя на мягкое воздействие наркотиков на выживание клеток. Также применение антиоксидант, который служит для защиты кожи от фототоксичности и фотообесцвечивания исключает использование прижизненной техники иммунофлюоресценции для изучения например, ткани окислительного стресса или азотной Biolog оксидау.
Наконец, ослепляя макрофагов ткани резидентов с иммунных комплексов может активировать эти клетки и влияние, например, при изучении тканей иммунной реакции и активации дендритных клеток.
Изменения и устранение неисправностей
Для изучения тканей окислительный стресс или азотной биологию оксида, аскорбиновая кислота должна быть заменены другими тканей совместимых носителей, не мешает экспериментальной продукции. Точно так же, блокирующие Fc рецепторы на кожных иммунных клеток следует избегать, если цель исследования заключается функция и активация тканевого иммунного ответа и активации дендритных клеток и миграции. Это может быть сделано с использованием вторичного антитела с Fc-фрагментом расщепленного (F (аb) 2-фрагменты антител) или использование биотинилированного антитела и флуоресцентного стрептавидина в качестве реагентов обнаружения.
Будущие приложения
Мы представляем новый и уникальный интражизненно важным, если метод для изображения компонентов не-фибриллярных внеклеточного матрикса в трансплантации опухолей кожи в сочетании с SHG-обнаруженного фибриллярных и созрели коллагенов, используя двухфотонного микроскопа. Одним из преимуществ использования нескольких фотонов (или конфокальной) микроскопии над изображениями эпифлуоресцентной является г-укладки возможность и в следствие пространственной совместная локализация событий, возникающих на внеклеточного матрикса, например опухоли intravasation в лимфатической или кровеносного сосуда, который в случае Стандарт эпифлуоресцентная микроскопии можно только вывести из морфологических изменений вторжения клетки. Этот метод имеет гораздо более широкий потенциал. Например, мы использовали прижизненной ЕСЛИ чтобы исследовать механизм лимфатической окклюзии по лимфатической конкретных фотодинамической терапии 27. Дополнительные возможности применения данного способа включают, но не ограничиваются ими исследовании иммунитета кожи во время воспаления, механизма отказа или методов крови и лимфы трансплантата рост судно ATIC во опухолей.
Критические шаги в процедуре
Самый важный шаг, который имеет важные последствия для поддержания физиологического среду ткани является хирургическая разделение брюшной кожи и хряща от спинных дермы. Разрезать или окклюзии основной артерии или вены приведет к чрезмерному кровотечению и местного гипоксии тканей, которые будут влиять на клеточный ответ на лечение и клеточного движения 8. Иммобилизации ухо хирургического клея должно быть сделано с осторожностью, так как разлив клей на подвергайте ткани вызовет постоянные травмы в ткани окклюзии кровеносных сосудов. Температура мыши необходимо контролировать и выдерживают при 37 ° С Кроме того, увлажненный кислород должен быть использован для изофлуран анестезии, так что глаза и легкие остаться должным образом увлажненный в ходе эксперимента. Кроме того, аскорбат натрия должны быть готовы недавно и его рН проверяется перед использованием.
ntent "> Таким образом, этот прижизненной иммунофлюоресценции мостов в реальном времени, локальные измерения физиологических функций с молекулярной визуализации сложных клеточных событий в коже мыши. Кроме того, этот метод имеет большой потенциал как она может быть легко применен к исследованию, например, после развития механизмы крови и лимфы-ангиогенеза или визуализировать ранние фазы инфекции кожи различными патогенными агентами. Благодаря гибкости и высокой пропускной потенциал, это прижизненный метод может внести существенный вклад в нескольких областях биологии.The authors have nothing to disclose.
Авторы благодарны Джереми CM Тео и С. Райан Оливера за их вклад и Иоланта Kilarska за помощь в обработке изображений. Мы благодарим основной механизм BioP в EPFL за поддержку с двухфотонного микроскопии
Эта работа была частично поддержана грантами Комиссии Европейского исследовательского (DC-лимфа, 206653-2), Европейской рамочной проекта 7 (AngioScaff), Швейцарского национального научного фонда (31-135756), и американского Национального института здоровья (NIH) / NIH сердца, легких и крови институт (NHLBI) (РВЫХ1 HL096539). Кроме того, средства от Роберта Wenner премии (Швейцарский Лиги Рак) разрешается покупка стереомикроскоп Leica использована в данном исследовании. Доноры не участвовал в разработке дизайна исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи.
Mice Strain | |||
BALB/C mice (8-12 weeks ) | Charles River | Orleans,France | |
C57/Bl6 Mice (8-12 weeks ) | Harlan | Carshalton UK | |
Cell Line | |||
B16 F10 Melanoma expressing OVA-GFP | |||
Anesthesia Maintenance | |||
Isofluorane | Minrad Inc. | 2222 | Minrad Inc., Buffalo, NY |
Humidified delivery system | Rothhacher GmBH | Berne, Switzerland | |
DC Temperature Control System | FHC Inc | Bowdoin, MA | |
Stereomicroscope | |||
Fluorescence stereomicroscope with a motorized stage . | M250 FA, Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
1× lens (linear system magnification from 7.5× to 160×) | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
2× lens (linear system magnification from 15.6× to 320×) | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
DFC 350 FX camera controlled by LAS AF software | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
Multiphoton Microscopy | |||
LEICA SP5, two-photon multiplier, motorized stage | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
HCX APO 20x/1.2 oil immersion | |||
Chameleon Ultra Laser | |||
Reagents | |||
Ringer's buffer (102 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 28 mM sodium lactate) | B. Braun Medical AG | 445968 | Sempach, Germany |
Aprotinin | Elastin | AP92 | Owensville, MO |
Thrombin | Sigma-Aldrich | T7326-1KU | Taufkirchen, Germany |
Sodium ascorbate | Sigma-Aldrich | 11140-50G | Taufkirchen, Germany |
Mouse Serum raised against human IgG | Abcam | ab34834 | Cambridge, UK |
Collagen IV | Abcam | AB6581 | Cambridge, UK |
Perlacan | RnD | ab79465 | Minneapolis, MN |
Tenascin C | RnD | AF3358 | Minneapolis, MN |
Podoplanin | RnD | AF3244 | Minneapolis, MN |
LYVE-1 | Reliatech | 103-PA50 | Wolfenbüttel, Germany |
CCL21 | RnD | AF457 | Minneapolis, MN |
Streptavidin Pacific Blue | Invitrogen | S11222 | Grand Island, NY |
Streptavidin Alexa 647 | Invitrogen | S21374 | Grand Island, NY |
Streptavidin Alexa 488 | Invitrogen | S11223 | Grand Island, NY |
Donkey Anti Goat 594 | Invitrogen | A21113 | Grand Island, NY |
Donkey Anti Rabbit 594 | Invitrogen | A21207 | Grand Island, NY |
CMTPX CellTracker | Lifetechnologies | C34552 | Carlsbad, California |
Histocryl (surgical glue) | Braun Aesculap | 1050060 | Tuttlingen, Germany |
Cell Culture Reagents | |||
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM | Gibco Invitrogen | E15-843 | Grand Island, NY |
Fetal bovine serum (FBS | Gibco Invitrogen | Grand Island, NY | |
Trypsin | Gibco Invitrogen | 25300062 | Grand Island, NY |
PBS | Gibco Invitrogen | Grand Island, NY |