Udarbejdelse af neuronale Co-kulturer med Single Cell Precision

Summary

Protokoller for enkelt neuron mikrofluid opstillingsindretningen og vand maskering for i chippen plasma mønstret af biomateriale belægninger beskrives. Stærkt sammenkoblede co-kulturer kan fremstilles ved anvendelse minimal celle indgange.

Abstract

Mikrofluidenheder udførelsesformer af Campenot kammer har tiltrukket stor interesse fra neurovidenskab samfund. Disse indbyrdes forbundne co-kultur platforme kan bruges til at undersøge en række spørgsmål, der spænder udviklingsmæssige og funktionelle neurobiologi til infektion og sygdom formering. Men konventionelle systemer kræver betydelige cellulære indgange (mange tusinde per rum), mangelfulde for at studere lav hyppighed celler, såsom primære dopaminerge substantia nigra, spiral ganglier, og Drosophilia melanogaster neuroner og upraktisk for high throughput eksperimenter. Den tætte kulturer er også meget lokalt sammenfiltrede, med få udvækster (<10%), der forbinder de to kulturer. I dette papir ligefremme mikrofluid og mønster protokoller er beskrevet som disse udfordringer: (i) en mikrofluid enkelt neuron arraying metode, og (ii) en vand maskering metode til plasma patterning biomateriale belægninger til auspicesSter neuroner og fremme udvækst mellem rummene. Minimalistiske neuronale co-kulturer blev fremstillet med højt niveau (> 85%) intercompartment forbindelse og kan anvendes til high throughput neurobiologi eksperimenter med enkelt celle præcision.

Introduction

Neuronvæv er meget kompleks; en heterogen cellulær blanding, der er rumligt bestilt inden for definerede lag og rum og med plastik tilslutning via celle kontakter og især via Axon og dendritceller udvækster. Nye teknikker er forpligtet til at give større eksperimentel frihed til at få dybere indsigt og optrævle mekanismer centrale for sygdom, udvikling og sund funktion. Den Campenot kammer ^1,2 og mere for nylig microfabricated udførelsesformer ^3,4 kan anvendes til ex vivo-fremstilling af netværksforbundne neuronale co-kulturer med evnen til selektivt at forstyrre de forskellige somatiske populationer og også deres neurit udvækster. Disse mikrofluidenheder er for eksempel blevet brugt til at studere axon degeneration og regeneration følgende kemiske ^5,6 eller laser axotomi ^6-8, tauopathy ^9, viral spredning ^10,11, og mRNA lokalisering i axoner ^4.

ent ">

At udvide rækkevidden af ​​synæstesi er den teknologiske udvikling, der kræves for at forberede minimalistiske neuronale co-kulturer. Dette muliggør molekyleudretningen af ​​den neuronale netværk for undersøgelse af systemet med en enkelt celle og sub-cellulær præcision. Kravet om minimale celleantal åbner mulighed for at analysere sjældne celletyper, herunder dopaminerge substantia nigra-celler er relevante for Parkinsons sygdom, spiral ganglier fra øret, perifere neuroner og stamceller. Ud over dette, cellulære økonomi er relevant for 3R-initiativet. Ved hjælp af disse mikrofluid platforme, store toksicitet skærme eller andre high throughput, kan nu betragtes data rige eksperimentel serie kræver dyr neuroner.

I dette papir protokoller for fremstilling og anvendelse af en mikrofluid anordning er beskrevet. Mikrofluid opstillingsindretningen i kombination med en in situ biomaterial mønster metode kan anvendes til registrering af tæt forbundne neuronale co-kulturer under anvendelse af minimale celleantal. Mikrofluid opstillingsindretningen er baseret på en differentiel strøm tilgang ^12-15, hvorved mikrostrukturerede fælder er placeret inden for en fluidisk kredsløb (illustreret sammen med SEM billeder i figur 1). Stien 0 → 1 har lavere fluidic modstand (R _2> R ₁₎ til transport af neuroner til en lineær række af mikrostrukturerede åbninger – indløb til de neuritvækst kanaler. Belægning af fælden ved en enkelt celle lokalt hæmmer flowet at aflede strømlinierne til at indfange de efterfølgende celler i tilstødende fælder. Komplet belægning af fælder i array skifter fluidic ratio _{(R1> R2)} for at omstille strømlinierne i Serpentine sti (0 → 2) for at frembringe en bypass driftsform til fjernelse af overskydende neuroner.

<p class = "jove_content" fo: keep-together.within-side = "altid">
Figur 1.. Mikrofluid Circuit. A) Den differentielle modstand fluidisk kredsløb for enkelt neuron opstillingsindretningen med flankerende kultur kamre er indbyrdes forbundet ved neuritudvækst kanaler. B, C) ​​SEM billeder af dobbeltlaget opdelte neuron co-kultur array med menisk pinning mikro-søjler. Med denne udformning blev Trident-formede neuron fældefangst strukturer anvendes til at fremme fascikulationer af neurit udvækster. Figur og legende gengivet med tilladelse fra Royal Society of Chemistry (RSC) ^12.. Klik her for at se større billede.

Udarbejdelsen af ​​micropatterned neuronale netværk på plane underlag kan let opnås (for exampl es fra vores gruppe, se FRIMAT et al. ¹⁶ og Heike et al. ^17). Men indkapsle bioaktive materiale mønstre indenfor PDMS enheder, og med kravet om mikrometer skala tilpasning af disse til de mikrofluidkanaler udgør en stor teknisk udfordring. I afsnit 3.1 en protokol for den i chippen, eller in situ, udarbejdelse af biomateriale mønstre præsenteres. Disse mønstre muliggøre neuron registrering under langvarige kultur tidsplaner og fremme udvækster mellem rummene. Menisk-pinning mikrostrukturer anvendes til at justere en såkaldt vand maske med neuron arraying sites og neuritudvækst kanaler. Vandet maske beskytter adhæsionsmolekyleaktiviteter belægninger under plasmabehandling, mens eksponerede overflader disintegreres at definere biomateriale mønster. Desuden er protokoller indeholdt cellekultur og fluidisk isolation nødvendig til selektiv behandling af de forskellige co-kultur kamre.

ve_content "> De protokoller er designet til at udnytte brugervenlige principper for blød litografi til replikation af poly (dimethylsiloxan) (PDMS) mikrofluidenheder ^18. Tilsvarende i situ biomateriale mønster er ligetil, udnytte fordampning og overfladespænding fænomener, og kun kræver en billig håndholdt plasma kilde. mikrofluid kredsløb effektivt programmer celle lastning og rum specifikke behandlinger, der gør disse operationer blot et spørgsmål om udlevering materialer i den rigtige bundporten og sugning ovenfra. På denne måde er det hensigten at give neurobiologer frihed til at forberede og anvende mikrofluidenheder i deres egne laboratorier.

Protocol

Protokollerne er beregnet til hjerneforskere, og er opsummeret i figur 2.. Som sådan er det anbefales at microfabrication af SU-8 mestre anvendes til PDMS replikering er outsourcet til kommercielle eller institutionelle faciliteter. De to lag maske designs er frit tilgængelige som supplerende oplysninger (ZIP) på Royal Society of Chemistry hjemmeside 12. Vigtigere er det, at det første SU-8 lag fremstilles i en dybde på 2,5-3,0 um, og den anden til en dybde på 25-30 um. Disse er vigtige…

Representative Results

Vand maskering exploits overfladespænding. Trykket tolerance på luft-væske grænsefladen skalaer omvendt proportionalt med krumningsradius [ , Der producerer meget stabile grænseflader på mikrofluidenheder dimensioner. De mikro-søjler effektivt forankre vand maske på plads. Vand maske dannelse er drevet af fordampning fra microfluidic havne med den steg med opvarmning. Ved hjælp af varmen fra lav forstørrelse (4x – 10x) mikrosk…

Discussion

Mikrofluid opstillingsindretningen teknik er den første af sin slags, der giver præcision enkelt neuron håndtering for at etablere minimalistiske kulturer. Sammen med in situ biomateriale mønster metode, en kraftfuld tilgang til at justere cellemønstre med microfluidic strukturer, disse minimalistiske kulturer har høj intercompartment tilslutningsmuligheder niveauer med reduceret lokal entanglement. Disse funktioner kan bruges til effektiv undersøgelse af inter-rum overførsel og med enkle design ændrin…

Materials

PDMS Sylgard 184	Dow Corning
PDMS Elastosil RT 601	Wacker
Coverslips	VWR	630-1590	130-160 mm thick
3 mm Biopsy Punches	Kai Medical		Handle with care – extremely sharp
Tygon Tubing	Fisher Scientific	S-50-HL	1.65 mm ID; 3.35 mm OD
1 mL Syringe (Inkjekt and Omnifix)	Braun	6064204
4-Way Tubing Connector	VWR or Fisher Scientific
Flow Regulator	Harvard Apparatus	722645
0.5 mm Pins	Dressmaking Departments
PLL-g-PEG	SuSoS	PLL(20)-g[3.5]-PEG(5)	Stability in storage can be an issue
poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	P6407
poly-lysine-FITC	Sigma-Aldrich	P3069
poly-ornithine	Sigma-Aldrich	P4957
fibronectin	Sigma-Aldrich	F2006
laminin	Sigma-Aldrich	L2020
PBS	Sigma-Aldrich	P4417
Inverted Fluorescent Microscope
Example Aspiration Pump	KNF Neuberger, Laboport	N811KVP
Hand Held Corona Discharge Device	Leybold-Heraeus, USA	VP23	May not comply with your country's safety standards
Femto Plasma Oven	Diener Electronic
Vacuum Dessicator or Centrifuge