Voorbereiding van Neuronale Co-culturen met Single Cell Precision
Summary
Protocollen voor enkel neuron microfluïdische arraying en water maskeren voor de in-chip plasma patroonvorming van biomateriaal coatings worden beschreven. Sterk verbonden co-culturen kan worden bereid met minimale cel ingangen.
Abstract
Microfluïdische uitvoeringen van de Campenot kamer hebben veel belangstelling trok van de neurowetenschappen. Deze onderling co-kweek platforms kunnen worden gebruikt om een verscheidenheid aan vragen te onderzoeken, verspreid ontwikkelings-en functionele neurobiologie infecties en ziekten propagatie. Echter, conventionele systemen zijn aanzienlijke cellulaire ingangen (duizenden per compartiment), matig voor het bestuderen lage abundantie cellen, zoals primaire dopaminerge substantia nigra, spiraal ganglia en neuronen Drosophilia melanogaster en onpraktisch voor hoge doorvoer experimenteren. De dichte culturen zijn ook zeer lokaal verstrengeld, met weinig uitwassen (<10%) onderling verbinden van de twee culturen. In deze paper eenvoudige microfluïdische en patroonvorming protocollen beschreven die deze uitdagingen aan: (i) een microfluïdisch enkel neuron arraying methode, en (ii) een water-masking methode voor plasma patroonvorming biomateriaal coatings te register de neuronen en bevorderen uitgroei tussen de compartimenten. Minimalistische neuronale co-cultures werden bereid met hoog niveau (> 85%) intercompartment connectiviteit en kan worden gebruikt voor high throughput neurobiologie experimenten met enkele cel precisie.
Introduction
Neuronaal weefsel is zeer complex; een heterogeen cellulaire mengsel dat ruimtelijk wordt besteld binnen bepaalde lagen en compartimenten en met plastic connectiviteit via de mobiele contacten en vooral via axon en dendriet uitwassen. Nieuwe technieken zijn nodig om meer experimentele vrijheid om diepere inzichten en mechanismen ontrafelen centraal in de ziekte, ontwikkeling en gezonde functie krijgen verlenen. De Campenot kamer 1,2 en meer recent microfabricated 3,4 uitvoeringsvormen kunnen worden gebruikt voor de ex vivo bereiding van neuronale netwerk co-kweken met de mogelijkheid om selectief verstoren de verschillende somatische populaties alsook hun neurieten uitwassen. Deze microfluïdische inrichtingen zijn bijvoorbeeld gebruikt om axon degeneratie en regeneratie studie volgende chemische 5,6 of laser axotomy 6-8, tauopathie 9, virale verspreiding 10,11 en mRNA lokalisatie in axonen 4.
ent ">Om het bereik van de neurobiologen breiden, zijn technologische ontwikkelingen nodig om minimalistische neuronale co-culturen te bereiden. Dit maakt ontvlechting van het neuronale netwerk voor het onderzoek naar het systeem met enkele cel en sub-cellulaire precisie. De vereiste minimale aantal cellen mogelijkheden voor de zeldzame celtypen, inclusief dopaminerge substantia nigra cellen ziekte van Parkinson, spiraal ganglia van het oor, perifere neuronen relevante analyseren en stamcellen. Afgezien van deze, cellulaire economie is aan het 3V-initiatief betrokken. Met behulp van deze microfluïdische platforms, grootschalige toxiciteit schermen of andere high throughput, kan data rijke experimentele serie waarbij dierlijke neuronen nu worden beschouwd.
In deze protocollen voor de vervaardiging en het gebruik van een microfluïdische inrichting worden beschreven. Microfluïdische arraying in combinatie met een in situ biomaterial patroonvorming methode kan worden gebruikt voor de registratie van sterk gekoppelde neuronale co-cultuur met minimale mobiele nummers. Microfluïdische arraying is gebaseerd op een differentiële stroom benadering 12-15, waarbij de microgestructureerde vallen worden geplaatst binnen een fluïdumkringloop (geïllustreerd met SEM-afbeeldingen in Figuur 1). Het pad 0 → 1 heeft de onderste vloeibare weerstand (R2> R1) voor het transporteren neuronen een lineaire reeks microgestructureerde openingen – de inlaten naar de neuriet uitgroei kanalen. Bezetting van de trap door een cel belemmert plaatselijk de stroom naar de stroomlijnen leiden voor het vangen latere cellen in naburige vallen. Volledige bezetting van de vallen in de array schakelt de vloeibare ratio (R 1> R 2) aan de stroomlijnen te leiden in de kronkelend pad (0 → 2) om een bypass modus operandi te produceren voor het verwijderen van overtollig neuronen.
<p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "altijd">
Figuur 1. Microfluidic Circuit. A) De differentiële weerstand fluïdumkringloop voor enkel neuron arraying, met begeleidende cultuur kamers verbonden door neurietuitgroei kanalen. B, C) SEM beelden van de dubbellaag verzuilde neuron co-cultuur array met meniscus pinning micropillars. Met dit ontwerp, werden drietand-vormige neuron trapping structuren gebruikt om fasciculatie van de neuriet uitwassen te promoten. Figuur en legende overgenomen met toestemming van de Royal Society of Chemistry (RSC) 12. Klik hier voor grotere afbeelding.
De voorbereiding van micropatterned neuronale netwerken op vlakke ondergronden kan gemakkelijk worden bereikt (voor exampl es uit onze groep, zie Frimat et al.. 16 en Heike et al.. 17). Echter, het inkapselen van bioactief materiaal patronen in PDMS-apparaten en met de eis van micrometer-schaal afstemming van deze aan de microfluïdische kanalen vormt een grote technische uitdaging. In paragraaf 3.1 een protocol voor de in-chip, of in situ, de voorbereiding van biomateriaal patronen wordt gepresenteerd. Deze patronen stellen neuron registratie bij langdurige cultuur termijnen en uitwassen tussen compartimenten te promoten. Meniscus-pinning microstructuren worden gebruikt om een zogenaamde water masker af te stemmen op de neuron arraying sites en neurietuitgroei kanalen. Het water masker beschermt adhesiemolecule coatings tijdens plasma behandeling, terwijl blootgestelde oppervlakken worden gedesintegreerd het biomateriaal patroon definiëren. Daarnaast zijn protocollen voorzien celcultuur en vloeibare isolatie voor de selectieve behandeling van de verschillende co-cultuur compartimenten.
ve_content "> De protocollen zijn ontworpen om de gebruiker ingestelde principes van zachte lithografie hefboomwerking voor de replicatie van poly (dimethylsiloxaan) (PDMS) microfluïdische inrichtingen 18. Ook in situ biomateriaal patroon is eenvoudig, verdamping en oppervlaktespanning verschijnselen exploiteren, en slechts waarbij een goedkope draagbare plasmabron. Het microfluïdische circuit effectief programma cel laden en compartimentspecifieke behandelingen die deze bewerkingen Op deze wijze is het de bedoeling een kwestie van doseren materialen in de juiste onderste poort en opzuigen van boven. de neurobiologists geven de vrijheid voor te bereiden en te gebruiken microfluïdische apparaten in hun eigen laboratoria.Protocol
Representative Results
Discussion
De microfluïdische arraying techniek is de eerste in zijn soort die precisie enkel neuron handling maakt voor het vaststellen van minimalistische culturen. In combinatie met de in situ biomateriaal patroonvorming methode, een krachtige aanpak van de cel patronen af te stemmen op microfluïdische structuren, deze minimalistische culturen hebben hoge intercompartment connectiviteit niveaus met beperkte lokale verstrengeling. Deze functies kunnen worden gebruikt voor de efficiënte onderzoek tussen compartimenten…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs zijn dankbaar Ulrich Marggraf (ISA's) bij SU-8 fabricage en Maria Becker (ISA) voor SEM beeldvorming. Het onderzoek werd financieel ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG WE3737/3-1), een Bundesministerium für Bildung und Forschung subsidie (BMBF 0101-31P6541) en door het Ministerium für Innovation, Wissenschaft und Forschung des Landes Nordrhein-Westfalen. Heike Hardelauf dankzij de Internationale Leibniz Graduate School "Systems Biology Lab-on-a-Chip" voor financiële steun.
Materials
| PDMS Sylgard 184 | Dow Corning | ||
| PDMS Elastosil RT 601 | Wacker | ||
| Coverslips | VWR | 630-1590 | 130-160 mm thick |
| 3 mm Biopsy Punches | Kai Medical | Handle with care – extremely sharp | |
| Tygon Tubing | Fisher Scientific | S-50-HL | 1.65 mm ID; 3.35 mm OD |
| 1 mL Syringe (Inkjekt and Omnifix) | Braun | 6064204 | |
| 4-Way Tubing Connector | VWR or Fisher Scientific | ||
| Flow Regulator | Harvard Apparatus | 722645 | |
| 0.5 mm Pins | Dressmaking Departments | ||
| PLL-g-PEG | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) | Stability in storage can be an issue |
| poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| poly-lysine-FITC | Sigma-Aldrich | P3069 | |
| poly-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | |
| laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Inverted Fluorescent Microscope | |||
| Example Aspiration Pump | KNF Neuberger, Laboport | N811KVP | |
| Hand Held Corona Discharge Device | Leybold-Heraeus, USA | VP23 | May not comply with your country's safety standards |
| Femto Plasma Oven | Diener Electronic | ||
| Vacuum Dessicator or Centrifuge |
References
- Campenot, R.B. Local control of neurite development by nerve growth factor. Proc Natl Acad Sci USA. 74 (10), 4516-4519 (1997).
- Campenot, R.B. Development of sympathetic neurons in compartmentalized cultures. I. Local control of neurite growth by nerve growth factor. Dev Biol. 93 (1), 1-12. (1982).
- Taylor, A.M., et al. Microfluidic multicompartment device for neuroscience research. Langmuir. 19, 1551-1556 (2003).
- Taylor, A.M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2 (8), 559-565 (2005).
- Kilinc, D., et al. Wallerian-like degeneration of central neurons after synchronized and geometrically registered mass axotomy in a three-compartmental microfluidic chip. Neurotox. Res. 19, 149-161 (2011).
- Li, L., et al. Spatiotemporally controlled and multifactor involved assay of neuronal regeneration after chemical injury in an integrated microfluidics. Anal. Chem. 84 (15), 6444-6453 (2012).
- Kim, Y.T., Karthikeyan, K., Chirvi S., & Dave, D.P. Neuro-optical microfluidic platform to study injury and regeneration of single axons, Lab Chip. 9, 2576-2581 (2009).
- Hellman, A. N., et al. Examination of axonal injury and regeneration in micropatterned neuronal culture using pulsed laser microbeam dissection. Lab Chip. 10 (16), 2083-2092 (2010).
- Kunze, A., et al. Co-pathological connected primary neurons in a microfluidic device for Alzheimer studies. Biotechnol. Bioeng. 108 (9), 2241-2245 (2011).
- Liu, W.W., Goodhouse, J., Jeon N.L., & Enquist, L. W. A microfluidic chamber for analysis of neuron-to-cell spread and axonal transport of an alpha-herpesvirus. PLoS One. 3 (6), e2382 (2008).
- Markus, A., et al. Varicella-Zoster virus (VZV) infection of neurons derived from human embryonic stem cells: Direct demonstration of axonal infection, transport of VZV, and productive neuronal infection. J. Virol. 85 (13), 6220-6233 (2011).
- Dinh, N.D., et al. Microfluidic construction of minimalistic neuronal co-cultures. Lab Chip. 13 (7), 1402–1412 (2013).
- Tan, W.H., & Takeuchi S. A trap-and-release integrated microfluidic system for dynamic microarray applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (4), 1146-1151 (2007).
- Frimat, J.-P., et al. A microfluidic array with cellular valving for single cell co-culture. Lab Chip. 11 (2), 231-237 (2011).
- Di Carlo, D. Aghdam, N., & Lee, L. P. Single-cell enzyme concentrations, kinetics, and inhibition analysis using high-density hydrodynamic cell isolation arrays. Anal. Chem. 78 (14), 4925-4930 (2006).
- Frimat, J.P., et al. The network formation assay: A spatially standardized neurite outgrowth analytical display for neurotoxicity screening. Lab Chip. 10, 701-709 (2010).
- Hardelauf, H., et al. High fidelity neuronal networks formed by plasma masking with a bilayer membrane: analysis of neurodegenerative and neuroprotective processes. Lab Chip. 11 (16), 2763-2771 (2011).
- Whitesides, G.M., et al. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).
- Haubert, K., Drier, T., & Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab Chip. 6,1548-1549 (2006).
- Frimat, J.P., et al. Plasma stencilling methods for cell patterning, Anal. Bioanal. Chem. 395 (3), 601-609 (2009).
- Huang, N.P., et al. Poly(L-lysine)-g-poly(ethylene glycol) layers on metal oxide surfaces: surface-analytical characterization and resistance to serum and fibrinogen adsorption. Langmuir. 17, 489-498 (2001).
- Li, N., & Folch, A. Integration of topographical and biochemical cues by axons during growth on microfabricated 3-D substrates. Exp. Cell Res. 311 (2), 307-316 (2005).
- Huang, L.R., Cox, E.C., Austin, R.H., & Sturm, J.C. Continuous particle separation through deterministic lateral displacement. Science. 304 (5673), 987-990 (2004).
- Yang, Z., et al. A review of nanoparticle functionality and toxicity on the central nervous system. J. R. Soc. Interface. 7, doi: 10.1098/rsif.2010.0158.focus (2010).
- Brenneman, K.A., et al. Direct olfactory transport of inhaled manganese ((MnCl2)-Mn-54) to the rat brain: Toxicokinetic investigations in a unilateral nasal occlusion model. Toxicol. Appl. Pharm. 169 (3) 238-248 (2000).
- Magalães, A.C., et al. Uptake and neuritic transport of scrapie prion protein coincident with infection of neuronal cells. J. Neurosci. 25 (21), 5207-5216 (2005).
- Diogenes, M. J., et al. Extracellular alpha-synuclein oligomers modulate synaptic transmission and impair LTP via NMDA-receptor activation. J Neurosci. 32 (34), 11750-11762 (2012).
- Egger, B., et al. In vitro imaging of primary neural cell culture from Drosophila. Nat. Protoc. 8 (5), 958-965 (2013).
