Préparation de neurones co-cultures avec l'unité portable de précision

Summary

Les protocoles pour seul neurone de formation de réseau microfluidique et le masquage de l'eau pour le motif de revêtements de biomatériaux plasma dans la puce sont décrits. Co-cultures fortement interconnectés peuvent être préparés en utilisant les entrées de cellules minimales.

Abstract

Réalisation microfluidiques de la chambre Campenot ont suscité un grand intérêt de la communauté des neurosciences. Ces plates-formes de co-culture interconnectés peuvent être utilisés pour étudier une variété de questions, allant de la neurobiologie développementale et fonctionnelle à l'infection et la propagation de la maladie. Cependant, les systèmes classiques nécessitent des apports importants cellulaires (plusieurs milliers par compartiment), l'insuffisance de l'étude des cellules de faible abondance, comme primaire nigra dopaminergique substance, les ganglions spirale, et les neurones de melanogaster de drosophile, et peu pratique pour l'expérimentation à haut débit. Les cultures denses sont également hautement enchevêtrées localement, avec quelques excroissances (<10%) interconnectant les deux cultures. Dans cet article, les protocoles microfluidiques et structuration simples qui sont décrits relever ces défis: (i) un seul neurone microfluidique méthode rangeant, et (ii) un procédé de masquage de l'eau pour la modélisation de plasma revêtements de biomatériaux à REGIster neurones et favoriser l'excroissance entre les compartiments. Co-cultures de neurones minimalistes ont été préparés avec de haut niveau (> 85%) connectivité autre et d'peuvent être utilisés pour des expériences à haut débit de la neurobiologie avec une précision d'une cellule unique.

Introduction

Tissu neuronal est très complexe; un mélange cellulaire hétérogène spatialement ordonné dans des couches et des compartiments définis et avec une connectivité plastique par des contacts cellulaires et en particulier par l'intermédiaire des axones et dendrites excroissances. De nouvelles techniques sont nécessaires pour conférer une plus grande liberté d'expérimentation pour gagner une compréhension plus profonde et mécanismes démêler centrales à la maladie, le développement et la fonction saine. La chambre Campenot ^1,2 et, plus récemment, des modes de réalisation microfabriqué ^3,4 peuvent être utilisés pour la préparation ex vivo des co-cultures de neurones en réseau ayant la capacité de perturber sélectivement les différentes populations somatiques et également leurs excroissances de neurites. Ces dispositifs microfluidiques ont par exemple été utilisés pour étudier la dégénérescence axonale et la régénération chimique suivante ^5,6 ou laser axotomie ^6-8, tauopathie ^9, la diffusion virale ^10,11, et la localisation des ARNm dans les axones ^4.

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Pour étendre la portée des neurobiologistes, les développements technologiques sont nécessaires pour préparer les co-cultures de neurones minimalistes. Cela permet désenchevêtrement du réseau neuronal pour l'étude du système avec une seule cellule et une précision sub-cellulaire. L'obligation pour les nombres de cellules minimaux ouvre la possibilité d'analyser les différents types de cellules rares, y compris les cellules de la substantia nigra dopaminergiques pertinents pour la maladie de Parkinson, les ganglions de la spirale de l'oreille, des neurones périphériques, et les cellules souches. Au-delà, l'économie cellulaire est pertinente à l'initiative 3R. L'utilisation de ces plates-formes microfluidiques, des écrans de toxicité à grande échelle ou d'autres haut débit, riche en données série expérimentale nécessitant des neurones des animaux peut maintenant être considérée.

Dans ce document, les protocoles pour la fabrication et l'utilisation d'un dispositif microfluidique sont décrits. Formation de réseau microfluidique en combinaison avec un biomateri in situProcédé de formation de motifs al peut être utilisé pour l'enregistrement des co-cultures de neurones fortement interconnectés en utilisant les nombres de cellules minimal. Formation de réseaux microfluidique est basé sur une approche de flux différentiel ^12-15, où les pièges microstructurées sont placés dans un circuit fluidique (illustré avec des images MEB de la figure 1). Le chemin 0 → 1 présente la plus faible résistance fluidique (R _2> R ₁₎ pour le transport de neurones à une rangée linéaire d'ouvertures microstructurées – les ports d'entrée vers les canaux de la croissance des neurites. Occupation du piège par une seule cellule empêche localement le flux de détourner les lignes de courant pour piéger les cellules suivantes dans les pièges voisins. Occupation totale des pièges contenus dans le tableau commute le rapport fluidique (R _1> R ₂₎ pour dévier les lignes de courant dans le trajet sinueux (0 → 2) pour produire un mode de fonctionnement en dérivation pour l'élimination des excès de neurones.

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Figure 1. Microfluidique circuit. A) Le circuit de résistance différentielle fluidique pour seule formation de réseaux de neurones, avec accompagnement des chambres de culture reliés entre eux par des canaux de la croissance des neurites. B, C images) au MEB de la bicouche neurone compartimentée matrice de co-culture avec des ménisques micropiliers goupiller. Avec cette conception, structures neurone piégeage en forme de trident ont été utilisés pour promouvoir fasciculation des excroissances de neurites. Figure et légende reproduit avec la permission de la Royal Society of Chemistry (RSC) ^12. Cliquez ici pour agrandir l'image.

La préparation des réseaux neuronaux microélectrodes sur des substrats planaires peut facilement être atteint (pour exampl es de notre groupe, voir Frimat et al. ¹⁶ et Heike et al. ^17). Cependant, l'encapsulation des motifs de matériau bioactif dans des dispositifs PDMS et à l'exigence d'alignement échelle micrométrique de ceux-ci aux canaux microfluidiques pose un défi technique majeur. Dans la section 3.1 un protocole pour l'en-puce, ou in situ, la préparation de modèles de biomatériaux est présenté. Ces modèles permettent l'enregistrement des neurones pendant de longues échelles de temps de la culture et de promouvoir des excroissances entre les compartiments. Microstructures ménisque-épinglage sont utilisées pour aligner une dite masque de l'eau avec le neurone sites et des canaux de l'excroissance de neurites rangeant. Le masque protège les revêtements de l'eau des molécules d'adhésion pendant le traitement au plasma, tandis que les surfaces exposées sont désintégrées pour définir le motif de biomatériau. En outre, les protocoles sont prévus pour la culture de cellules et pour l'isolation fluidique nécessaire pour le traitement sélectif des différents compartiments de co-culture.

ve_content "> Les protocoles sont conçus pour tirer parti des principes conviviales de lithographie douce pour la réplication de poly (diméthyl) (PDMS) des dispositifs microfluidiques ^18. De même, biomatériau in situ structuration en est simple, l'exploitation évaporation de surface et les phénomènes de tension, et seulement nécessitant une source de plasma portatif peu coûteux. Circuit microfluidique efficacement les traitements spécifiques des programmes de chargement de la cellule et des soutes qui rend ces opérations simplement une question de la distribution des matériaux dans l'orifice inférieur correspondant et l'aspiration par le haut. De cette manière, il est destiné à donner les neurobiologistes la liberté de préparer et d'utiliser des dispositifs microfluidiques dans leurs propres laboratoires.

Protocol

Les protocoles sont conçus pour les neuroscientifiques, et sont résumées dans la figure 2. Comme tel, il est recommandé que la microfabrication des SU-8 maîtres utilisés pour la réplication PDMS est sous-traitée à des installations commerciales ou institutionnelles. Les deux modèles de masques de couche sont disponibles gratuitement que les informations complémentaires (ZIP) de la Société royale du site Chimie 12. Fait important, le SU-8 première couche doit être fabriqué sur …

Representative Results

exploits de masquage de l'eau de surface tension. La tolérance à la pression à l'interface air-liquide échelles inversement avec le rayon de courbure [ , Produisant des interfaces très stables à des dimensions microfluidiques. Les micropiliers ancrer efficacement le masque de l'eau en place. formation d'un masque de l'eau est conduite par évaporation à partir des ports microfluidiques, avec l'augmentation…

Discussion

La technique de formation de réseau microfluidique est le premier de son genre qui permet une manipulation simple neurone de précision pour établir cultures minimalistes. Couplé avec la méthode in situ de structuration biomatériau, une approche puissante pour aligner les modèles de cellules avec des structures microfluidiques, ces cultures minimalistes ont des niveaux de connectivité haut de intercompartment à une réduction de l'enchevêtrement local. Ces caractéristiques peuvent être u…

Materials

PDMS Sylgard 184	Dow Corning
PDMS Elastosil RT 601	Wacker
Coverslips	VWR	630-1590	130-160 mm thick
3 mm Biopsy Punches	Kai Medical		Handle with care – extremely sharp
Tygon Tubing	Fisher Scientific	S-50-HL	1.65 mm ID; 3.35 mm OD
1 mL Syringe (Inkjekt and Omnifix)	Braun	6064204
4-Way Tubing Connector	VWR or Fisher Scientific
Flow Regulator	Harvard Apparatus	722645
0.5 mm Pins	Dressmaking Departments
PLL-g-PEG	SuSoS	PLL(20)-g[3.5]-PEG(5)	Stability in storage can be an issue
poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	P6407
poly-lysine-FITC	Sigma-Aldrich	P3069
poly-ornithine	Sigma-Aldrich	P4957
fibronectin	Sigma-Aldrich	F2006
laminin	Sigma-Aldrich	L2020
PBS	Sigma-Aldrich	P4417
Inverted Fluorescent Microscope
Example Aspiration Pump	KNF Neuberger, Laboport	N811KVP
Hand Held Corona Discharge Device	Leybold-Heraeus, USA	VP23	May not comply with your country's safety standards
Femto Plasma Oven	Diener Electronic
Vacuum Dessicator or Centrifuge