La réponse immunitaire de l'hôte à l'infection par des pathogènes est un processus étroitement régulé. Utilisant un poumon modèle d'exposition de lipopolysaccharide chez la souris, il est possible de procéder à des évaluations de haute résolution des mécanismes complexes associés à la pathogenèse de la maladie.
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Article de méthode
L'utilisation de l'oropharynx Intratrachéal PAMP administration et lavage broncho-alvéolaire pour évaluer l'hôte une réaction immunitaire chez la souris
Dans cet article
Résumé
Résumé
La réponse immunitaire de l'hôte à des agents pathogènes est un processus biologique complexe. La majorité des études in vivo utilisé classiquement pour caractériser les interactions hôte-pathogène profiter des injections intra-péritonéales de sélectionner des bactéries ou des motifs moléculaires de pathogènes associés (PAMP) chez la souris. Bien que ces techniques ont donné des données énormes liés à pathobiology des maladies infectieuses, les modèles d'injection intrapéritonéale sont pas toujours appropriés pour les études d'interaction hôte-pathogène dans les poumons. Utilisant un modèle d'inflammation pulmonaire aiguë chez la souris, il est possible de procéder à une analyse à haute résolution de l'hôte réponse immunitaire innée utilisant le lipopolysaccharide (LPS). Ici, nous décrivons les méthodes d'administration de LPS en utilisant non chirurgicale administration intratrachéale oropharyngée, de surveiller les paramètres cliniques associés à la pathogenèse de la maladie, et d'utiliser le liquide de lavage broncho-alvéolaire pour évaluer la réponse immunitaire de l'hôte. Les techniques qui sont décritessont largement applicable pour l'étude de la réponse immunitaire innée hôte à un large éventail de PAMP et les agents pathogènes. De même, avec des modifications mineures, ces techniques peuvent également être appliquées dans des études évaluant l'inflammation allergique des voies aériennes et dans des applications pharmacologiques.
Introduction
Les infections pulmonaires associés aux espèces de bactéries pathogènes sont une cause fréquente de morbidité et de mortalité dans le monde. Déterminer les mécanismes qui conduisent la réponse immunitaire de l'hôte à ces agents pathogènes favorisera le développement de nouvelles stratégies de prévention et des agents thérapeutiques qui atténuent l'impact de ces infections. L'objectif global du protocole décrit ici est de fournir à l'utilisateur une méthode flexible pour évaluer l'hôte réponse immunitaire innée à l'infection par des agents pathogènes en utilisant un modèle de l'agent pathogène associé moléculaire (PAMP) comme un substitut p....
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Protocole
Toutes les études ont été menées sous l'approbation du Comité des soins et institutionnel (IACUC) pour Virginia Tech et en conformité avec les National Institutes of Health Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire.
Une. Intratrachéale (it) inoculation de LPS aide de l'Administration de l'oropharynx
- Assurez-vous que chaque animal est identifié en utilisant soit un coup de poing de l'oreille, une étiquette d'oreille, ou toute autre méthode approuvée institutionnellement.
- Noter le poids corporel de base et la température du corps de chaque animal.
- Préparer le ....
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Résultats
Les parois cellulaires des bactéries Gram-négatives sont constituées de LPS, ce qui est très abondant dans l'environnement. L'inhalation de LPS dans les populations humaines sensibles exacerbe réactivité des voies respiratoires et est capable de déclencher une response11 immunitaire robuste. LPS est également un PAMP commun utilisé dans des modèles de souris pour induire une réponse immunitaire innée robuste. Dans le protocole décrit ici, les souris ont reçu une dose de LPS il isolé de E. coli (sérotype.......
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Discussion
Les étapes les plus critiques pour l'évaluation avec succès la réponse immunitaire de l'hôte dans les poumons de souris est comme suit: 1) choisir la souche de souris approprié et le sexe pour le modèle en cours d'évaluation; 2) optimiser la livraison de PAMP pour les poumons; 3) recueillir et traiter correctement la BALF; et 4) fixer correctement et préparer des poumons pour l'évaluation histopathologique.
Le choix de la souche de souris est un facteur important dans l'é.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrents.
Remerciements
Les auteurs remercient le Collège régional VA-MD de la médecine vétérinaire pour fournir de base et de soutien technique pour ce projet. Ce travail est soutenu par un Career Development Award NIH (K01DK092355).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| C57Bl/6J | The Jackson Laboratory | Stock 000664 | |
| Balance compacte | Ohaus Scale Corporation | 71142845 | |
| Thermomètre rectal pour petits animaux | Braintree Scientific | TH 5 | |
| Sonde rectale pour rongeurs | Braintree Scientific | RET 3 | |
| Ear Punch | Braintree Scientific | EP-S 901 | |
| Lipopolysaccharide de E. coli 0111 :B4 | InvivoGen | LPS-EB | |
| 1x Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-023 | |
| Isoflurane | Baxter | 40032609 | |
| Intratrachael Administration et gonflage pulmonaire Stand | ICAP Manufacturing | n/a | |
| Stand d’intubation de rongeurs | Braintree Scientific | RIS 100 | |
| Ciseaux (émoussés/tranchants) | Fisher Scientific | 13-806-2 | |
| pinces (droites) | Fisher Scientific | 22-327-379 | |
| pinces (45º ;, courbes) | Fisher Scientific | 10-275 | |
| Ciseaux (émoussés/émoussés) | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Pipette (200 µ ; l Capacité) | Gilson | F123601 | |
| Ethanol | Sigma | 459844 | |
| Seringue de 1 ml | BD Medical | 301025 | |
| Seringue de 10 ml | BD Medical | 301604 | |
| 27 g x 0,5 po | 305109 Fisher | ||
| Scientific | 13-100-676 | ||
| Canules trachéales de 1,2 mm avec adaptateur Luer | Appareil Harvard | 732836 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-076 | |
| Suture chirurgicale tressée en soie 4-0 | Ethicon | A183 | |
| Kits de connecteur Luer à tube | Appareil Harvard | 721406 | |
| Kit Luer Stopcock Appareil | Harvard | 721664 | |
| Tygon formula E-3603 Tubulure de laboratoire | Sigma | R-3603 | |
| Solution de formol, tamponnée neutre, 10 % | Sigma | HT501128-4L | |
| Souris IL-1&beta ; OptEIA ELISA Kit | BD Biosciences | 559603 | |
| souris IL-6 OptEIA Kit ELISA | BD Biosciences | 550950 | |
| souris TNF-&alpha ; OptEIA ELISA Kit | BD Biosciences | 560478 | |
| Hémocytomètre | Hausser Scientific | 3520 | |
| Hémocytomètre Lunettes de protection | Thermo Scientific | 22-021-801 | |
| Trypan Blue | Thermo Scientific | SV3008401 | |
| Clips d’entonnoir de cytologie | Fisher Scientific | 10-357 | |
| Entonnoirs de cytologie | Fisher Scientific | 10-354 | |
| Cartes filtres | Fisher Scientific | 22-030-410 | |
| Lames de microscope | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| Lunettes de protection | Fisher Scientific | 12-540A | |
| Cytospin Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | |
| Diff Kit de coloration rapide | Fisher Scientific | ||
| Permount Support de montage | Fisher Scientific | SP15-500 |
Références
- Matute-Bello, G., et al. An official American Thoracic Society workshop report: features and measurements of experimental acute lung injury in animals. Am. J. respir. Cell Mol. Biol. 44, 725-738 (2011).
- Egger, C., et al.
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Réimpressions et autorisations
