L'utilisation de l'oropharynx Intratrachéal PAMP administration et lavage broncho-alvéolaire pour évaluer l'hôte une réaction immunitaire chez la souris
Summary
La réponse immunitaire de l'hôte à l'infection par des pathogènes est un processus étroitement régulé. Utilisant un poumon modèle d'exposition de lipopolysaccharide chez la souris, il est possible de procéder à des évaluations de haute résolution des mécanismes complexes associés à la pathogenèse de la maladie.
Abstract
La réponse immunitaire de l'hôte à des agents pathogènes est un processus biologique complexe. La majorité des études in vivo utilisé classiquement pour caractériser les interactions hôte-pathogène profiter des injections intra-péritonéales de sélectionner des bactéries ou des motifs moléculaires de pathogènes associés (PAMP) chez la souris. Bien que ces techniques ont donné des données énormes liés à pathobiology des maladies infectieuses, les modèles d'injection intrapéritonéale sont pas toujours appropriés pour les études d'interaction hôte-pathogène dans les poumons. Utilisant un modèle d'inflammation pulmonaire aiguë chez la souris, il est possible de procéder à une analyse à haute résolution de l'hôte réponse immunitaire innée utilisant le lipopolysaccharide (LPS). Ici, nous décrivons les méthodes d'administration de LPS en utilisant non chirurgicale administration intratrachéale oropharyngée, de surveiller les paramètres cliniques associés à la pathogenèse de la maladie, et d'utiliser le liquide de lavage broncho-alvéolaire pour évaluer la réponse immunitaire de l'hôte. Les techniques qui sont décritessont largement applicable pour l'étude de la réponse immunitaire innée hôte à un large éventail de PAMP et les agents pathogènes. De même, avec des modifications mineures, ces techniques peuvent également être appliquées dans des études évaluant l'inflammation allergique des voies aériennes et dans des applications pharmacologiques.
Introduction
Les infections pulmonaires associés aux espèces de bactéries pathogènes sont une cause fréquente de morbidité et de mortalité dans le monde. Déterminer les mécanismes qui conduisent la réponse immunitaire de l'hôte à ces agents pathogènes favorisera le développement de nouvelles stratégies de prévention et des agents thérapeutiques qui atténuent l'impact de ces infections. L'objectif global du protocole décrit ici est de fournir à l'utilisateur une méthode flexible pour évaluer l'hôte réponse immunitaire innée à l'infection par des agents pathogènes en utilisant un modèle de l'agent pathogène associé moléculaire (PAMP) comme un substitut pour les bactéries vivantes. La majorité des études antérieures évaluant l'hôte réponse immunitaire innée aux bactéries ont mis l'accent sur les modèles péritonéale en raison de la relative facilité d'exécution. Bien que ces modèles sont très utiles et ont donné lieu à des avancées significatives dans le domaine des interactions hôte-pathogène et l'inflammation systémique, les données générées à partir de ces modèles ne sont pas toujours appropriés pour les études involving le système respiratoire. Ici, un modèle d'inflammation pulmonaire aiguë du poumon est proposé comme une extension pratique et cliniquement pertinente de l'intra-péritonéale (ip), les modèles d'injection classiques. La technique proposée permet l'évaluation locale de la réponse immunitaire innée dans un système de modèle spécifique d'organe.
Les méthodes décrites ici sont conçues pour fournir une technique simple et robuste pour permettre aux utilisateurs d'évaluer la réponse immunitaire de l'hôte au LPS, qui est un PAMP commun. Les méthodes sont basées sur intratrachéale (it) instillation de LPS, ce qui induit une réponse immunitaire innée robuste dans les poumons de souris et imite de nombreuses caractéristiques physiopathologiques observés chez des patients humains souffrant d'infections respiratoires et de lésions pulmonaires aiguës 1. Un avantage principal de cette technique est qu'elle permet à l'utilisateur d'évaluer la réponse immunitaire de l'hôte sans les facteurs de confusion et des problèmes de sécurité liés à la réalisation des études in vivoà l'aide de bactéries vivantes. De même, l'administration de ce parcours oropharyngée de l'exposition décrite dans ce protocole présente des avantages significatifs par rapport aux autres techniques couramment utilisées, y compris par voie intranasale (dans) l'administration et la gestion de ce chirurgical. Par exemple, l'administration du dosage, il permet oropharyngée relativement précise et dépôt dans les poumons, comparativement à l'administration, qui souffre généralement d'une augmentation de la variabilité de dépôt dans les poumons à cause de la perte d'agents dans la cavité nasale, des sinus de 2-4. La voie d'administration de ces cavités, il contourne et permet un accès direct à la trachée et les voies respiratoires. De même, l'approche chirurgicale est une méthode d'administration beaucoup plus morbide et nécessite une formation approfondie à maîtriser. Les protocoles décrits ici comprennent également une description des techniques courantes et des marqueurs de substitution utilisés pour évaluer la progression de l'inflammation et se terminer par un protocole décrivant les techniques appropriées pour la préparation de la luNGS pour l'évaluation de l'histopathologie. Ces protocoles sont concentrés sur la réduction du nombre de souris requis pour chaque étude en maximisant les données générées à partir de chaque animal individuel.
Les protocoles décrits sont très flexibles et peuvent être facilement modifiés pour évaluer une diversité PAMP de gamme et des modèles moléculaires de dommages associé (atténue). En outre, moyennant quelques modifications supplémentaires, ces protocoles peuvent également être appliqués à des études évaluant allergique des voies aériennes progression de la maladie ou des interactions hôte-pathogène avec des bactéries vivantes, des virus ou des champignons 5-10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les étapes les plus critiques pour l'évaluation avec succès la réponse immunitaire de l'hôte dans les poumons de souris est comme suit: 1) choisir la souche de souris approprié et le sexe pour le modèle en cours d'évaluation; 2) optimiser la livraison de PAMP pour les poumons; 3) recueillir et traiter correctement la BALF; et 4) fixer correctement et préparer des poumons pour l'évaluation histopathologique.
Le choix de la souche de souris est un facteur important da…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient le Collège régional VA-MD de la médecine vétérinaire pour fournir de base et de soutien technique pour ce projet. Ce travail est soutenu par un Career Development Award NIH (K01DK092355).
Materials
| C57Bl/6J | The Jackson Laboratory | Stock 000664 |
| Compact Scale | Ohaus Scale Corporation | 71142845 |
| Small Animal Rectal Thermometer | Braintree Scientific | TH 5 |
| Rectal Probe for Rodents | Braintree Scientific | RET 3 |
| Ear Punch | Braintree Scientific | EP-S 901 |
| Lipopolysaccharide from E. coli 0111:B4 | InvivoGen | LPS-EB |
| 1x Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-023 |
| Isoflurane | Baxter | 40032609 |
| Intratrachael Administration and Lung Inflation Stand | ICAP Manufacturing | n/a |
| Rodent Intubation Stand | Braintree Scientific | RIS 100 |
| Scissors (blunt/sharp) | Fisher Scientific | 13-806-2 |
| forceps (straight) | Fisher Scientific | 22-327-379 |
| forceps (45º, curved) | Fisher Scientific | 10-275 |
| Scissors (blunt/blunt) | Fisher Scientific | 08-940 |
| Pipette (200 µl Capacity) | Gilson | F123601 |
| Ethanol | Sigma | 459844 |
| 1 ml Syringe | BD Medical | 301025 |
| 10 ml Syringe | BD Medical | 301604 |
| 27 G x 0.5 in. needle | BD Medical | 305109 |
| Refrigerated Microcentrifuge | Fisher Scientific | 13-100-676 |
| 1.2 mm Tracheal Cannulae with Luer-adapter | Harvard Apparatus | 732836 |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-076 |
| 4-0 Silk Braided Surgical Suture | Ethicon | A183 |
| Luer to Tube Connector Kits | Harvard Apparatus | 721406 |
| Luer Stopcock Kit | Harvard Apparatus | 721664 |
| Tygon formula E-3603 laboratory tubing | Sigma | R-3603 |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501128-4L |
| Mouse IL-1β OptEIA ELISA Kit | BD Biosciences | 559603 |
| Mouse IL-6 OptEIA ELISA Kit | BD Biosciences | 550950 |
| Mouse TNF-α OptEIA ELISA Kit | BD Biosciences | 560478 |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 3520 |
| Hemacytometer Cover Glasses | Thermo Scientific | 22-021-801 |
| Trypan Blue | Thermo Scientific | SV3008401 |
| Cytology Funel Clips | Fisher Scientific | 10-357 |
| Cytology Funels | Fisher Scientific | 10-354 |
| Filter Cards | Fisher Scientific | 22-030-410 |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-1 |
| Cover Glasses | Fisher Scientific | 12-540A |
| Cytospin Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 |
| Diff Quick Staining Kit | Fisher Scientific | 47733150 |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-500 |
References
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