マウスにおける宿主の免疫応答を評価する口腔咽頭気管内PAMP管理および気管支肺胞の活用
Summary
病原体感染に対する宿主の免疫応答が厳密に調節されたプロセスである。マウスにおけるリポ多糖肺露光モデルを利用し、それは疾患の病因に関連付けられている複雑な機構の高解像度の評価を実施することができる。
Abstract
病原体に対する宿主免疫応答は、複雑な生物学的プロセスである。 インビボ研究の大部分は、古典的宿主-病原体相互作用は、マウスにおけるセレクト細菌または病原体関連分子パターン（PAMP）の腹腔内注射を活用特徴付けるために用いられる。これらの技術は、感染症の病理生物学に関連した膨大なデータが得られているが、腹腔内注射モデルは常に、肺における宿主 – 病原体相互作用の研究には適していません。マウスにおける急性肺炎症モデルを利用し、それは先天性免疫応答は、リポ多糖（LPS）を利用してホストの高分解能解析を行うことができる。ここでは、非外科的口腔咽頭気管内投与を使用して、LPSを投与し、疾患の病因に関連する臨床パラメータをモニタし、宿主の免疫応答を評価するために気管支肺胞洗浄液を利用する方法を記載している。記載されている技術のPAMPおよび病原体の多様な範囲に対する宿主自然免疫応答を研究するために広く適用可能である。同様に、若干の変更を加え、これらの技術はまた、アレルギー性気道炎症を評価する研究および薬理学的用途に適用することができる。
Introduction
病原性細菌種に関連する肺感染は、世界的な罹患率および死亡率の一般的な原因である。これらの病原体に対する宿主の免疫応答をドライブするメカニズムを決定することは、これらの感染症の影響を減衰させる新たな予防戦略と治療薬の開発を推進していきます。ここに記載されたプロトコルの全体的な目標は、生きた細菌の代用物としての病原体関連分子パターン（PAMP）を用いて病原体感染に対する宿主の先天性免疫応答を評価するために柔軟な方法をユーザに提供することである。細菌に対する宿主自然免疫応答を評価する以前の研究の大部分は、実行が比較的容易に腹膜モデルに焦点を当てている。これらのモデルは非常に有用であり、宿主 – 病原相互作用および全身性炎症分野で大きな進歩をもたらしましたが、これらのモデルから生成されたデータには、常に問題研究のための適切ではありませんinvolvi呼吸器系ngの。ここでは、急性肺炎症の肺モデルは、古典的な腹腔内（ip）注射モデルの実用的かつ臨床的に関連する拡張として提案されている。提案された技術は、器官特異的モデル系における先天性免疫応答の局所的評価を可能にする。
ここで説明する方法は、ユーザが共通のPAMPであるLPSに対する宿主の免疫応答を評価することを可能にするための簡単かつ堅牢な技術を提供するように設計されている。方法は、マウスおよび呼吸器感染症及び急性肺障害に罹患している1ヒト患者において観察される病態生理学的特徴の多くを模倣するの肺におけるロバストな先天性免疫応答を誘導するLPSの気管内（it）点滴に基づいている。この技術の主な利点は、ユーザがインビボ研究導通に関連付けられた交絡因子および安全性の懸念なしに宿主免疫応答を評価することを可能にすることである生菌を使用した。同様に、このプロトコルで説明した露光の口腔咽頭のIT投与経路は、行政（中）、鼻腔内、外科、IT管理など、他の一般的に利用された技術、上の重要な利点を持っています。例えば、口腔咽頭IT管理は、典型的に、鼻腔内のエージェントの損失に肺沈着の増加変動を患っており、2〜4洞管理、中に比べて比較的正確な投薬および肺沈着を可能にします。それの投与経路は、これらの空洞を回避し、気管や気道に直接アクセスすることができます。同様に、外科的なITアプローチは、かなり多くの病的な投与方法で、マスターに広範囲の訓練を必要とします。ここで説明するプロトコルも記述一般的な技術と炎症の進行を評価し、LUを調製するための適切な技術を記載したプロトコルで終了するために使用する代理マーカーが含まれる組織病理学的評価のためのNGS。これらのプロトコルは、各々の動物から生成されたデータを最大にすることによって、各試験に必要なマウスの数を最小化に焦点を当てている。
記載されたプロトコルは、非常に柔軟であり、容易に多様な範囲のPAMPのダメージ関連分子パターン（減衰）を評価するために修飾することができる。さらに、いくつかの追加の修飾と、これらのプロトコルはまた、アレルギー性気道疾患の進行または生細菌、ウイルスまたは真菌5-10有する宿主-病原体相互作用を評価する研究に適用することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
成功したマウスの肺における宿主免疫応答を評価するための最も重要なステップは次のとおりです。1）評価対象モデルに適したマウス系統、性別を選択する。 2）肺へのPAMPの配信を最適化する。 3）正しくBALFを収集し、処理する。そして4）適切に修正し、組織病理学的評価のための肺の準備。
マウス株の選択は、宿主の免疫応答を評価する上で重要な要因である。 C57BL…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、このプロジェクトの中核と技術サポートを提供するための獣医薬のVA-MDリージョナルカレッジに感謝します。この作品は、NIHのキャリア開発賞（K01DK092355）でサポートされています。
Materials
| C57Bl/6J | The Jackson Laboratory | Stock 000664 |
| Compact Scale | Ohaus Scale Corporation | 71142845 |
| Small Animal Rectal Thermometer | Braintree Scientific | TH 5 |
| Rectal Probe for Rodents | Braintree Scientific | RET 3 |
| Ear Punch | Braintree Scientific | EP-S 901 |
| Lipopolysaccharide from E. coli 0111:B4 | InvivoGen | LPS-EB |
| 1x Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-023 |
| Isoflurane | Baxter | 40032609 |
| Intratrachael Administration and Lung Inflation Stand | ICAP Manufacturing | n/a |
| Rodent Intubation Stand | Braintree Scientific | RIS 100 |
| Scissors (blunt/sharp) | Fisher Scientific | 13-806-2 |
| forceps (straight) | Fisher Scientific | 22-327-379 |
| forceps (45º, curved) | Fisher Scientific | 10-275 |
| Scissors (blunt/blunt) | Fisher Scientific | 08-940 |
| Pipette (200 µl Capacity) | Gilson | F123601 |
| Ethanol | Sigma | 459844 |
| 1 ml Syringe | BD Medical | 301025 |
| 10 ml Syringe | BD Medical | 301604 |
| 27 G x 0.5 in. needle | BD Medical | 305109 |
| Refrigerated Microcentrifuge | Fisher Scientific | 13-100-676 |
| 1.2 mm Tracheal Cannulae with Luer-adapter | Harvard Apparatus | 732836 |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-076 |
| 4-0 Silk Braided Surgical Suture | Ethicon | A183 |
| Luer to Tube Connector Kits | Harvard Apparatus | 721406 |
| Luer Stopcock Kit | Harvard Apparatus | 721664 |
| Tygon formula E-3603 laboratory tubing | Sigma | R-3603 |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501128-4L |
| Mouse IL-1β OptEIA ELISA Kit | BD Biosciences | 559603 |
| Mouse IL-6 OptEIA ELISA Kit | BD Biosciences | 550950 |
| Mouse TNF-α OptEIA ELISA Kit | BD Biosciences | 560478 |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 3520 |
| Hemacytometer Cover Glasses | Thermo Scientific | 22-021-801 |
| Trypan Blue | Thermo Scientific | SV3008401 |
| Cytology Funel Clips | Fisher Scientific | 10-357 |
| Cytology Funels | Fisher Scientific | 10-354 |
| Filter Cards | Fisher Scientific | 22-030-410 |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-1 |
| Cover Glasses | Fisher Scientific | 12-540A |
| Cytospin Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 |
| Diff Quick Staining Kit | Fisher Scientific | 47733150 |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-500 |
References
- Matute-Bello, G., et al. An official American Thoracic Society workshop report: features and measurements of experimental acute lung injury in animals. Am. J. respir. Cell Mol. Biol. 44, 725-738 (2011).
- Egger, C., et al. Administration of bleomycin via the oropharyngeal aspiration route leads to sustained lung fibrosis in mice and rats as quantified by UTE-MRI and histology. PloS one. 8, (2013).
- Rayamajhi, M., et al. Nonsurgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry. J. Vis. Exp. , (2011).
- Revelli, D. A., Boylan, J. A., Gherardini, F. C. A non-invasive intratracheal inoculation method for the study of pulmonary melioidosis. Front. Cell. Infect. Microbiol. 2, 164 (2012).
- Allen, I. C., et al. Analysis of NLRP3 in the development of allergic airway disease in mice. J. Immunol. 188, 2884-2893 (2012).
- Allen, I. C., et al. Characterization of NLRP12 during the in vivo host immune response to Klebsiella pneumoniae and Mycobacterium tuberculosis. PloS one. , (2013).
- Allen, I. C., et al. Expression and function of NPSR1/GPRA in the lung before and after induction of asthma-like disease. Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 291, 1005-1017 (2006).
- Kebaier, C., et al. Staphylococcus aureus alpha-hemolysin mediates virulence in a murine model of severe pneumonia through activation of the NLRP3 inflammasome. J. Infect. Dis. 205, 807-817 (2012).
- Roberts, R. A., et al. Analysis of the murine immune response to pulmonary delivery of precisely fabricated nano- and microscale particles. PloS one. 8, (2013).
- Willingham, S. B., et al. NLRP3 (NALP3, Cryopyrin) facilitates in vivo caspase-1 activation, necrosis, and HMGB1 release via inflammasome-dependent and -independent pathways. J. Immunol. 183, 2008-2015 (2009).
- Kline, J. N., et al. Variable airway responsiveness to inhaled lipopolysaccharide. Am. J. Respir. Crit. Med. 160, 297-303 (1999).
- Cressman, V. L., Hicks, E. M., Funkhouser, W. K., Backlund, D. C., Koller, B. H. The relationship of chronic mucin secretion to airway disease in normal and CFTR-deficient mice. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 19, 853-866 (1998).
