Utnyttelsen av orofaryngeal røret PAMP Administrasjon og Bronchoalveolar Lavage å evaluere vertens immunrespons i Mus
Summary
Vertsimmunresponsen mot patogen infeksjon er en strengt regulert prosess. Ved hjelp av en lipopolysakkarid lunge eksponering modell i mus, er det mulig å drive med høy oppløsning evalueringer av de komplekse mekanismer forbundet med sykdoms patogenesen.
Abstract
Vertsimmunresponsen mot patogener er en kompleks biologisk prosess. De fleste in vivo studier klassisk anvendt for å karakterisere verts-patogen interaksjoner utnytte intraperitoneale injeksjoner av utvalgte bakterier eller patogen forbindelse molekyl mønstre (PAMPs) i mus. Mens disse teknikkene har gitt enorme data i forbindelse med smittsomme sykdommer patobiologi, intraperitoneal injeksjon modeller er ikke alltid hensiktsmessig for host-patogen interaksjonsstudier i lungen. Ved hjelp av en akutt lungebetennelse modell i mus, er det mulig å gjennomføre en høyoppløsnings-analyse av verten medfødte immunrespons anvendelse av lipopolysakkarid-(LPS). Her beskriver vi metoder for å administrere LPS hjelp nonsurgical orofaryngeal intratrakeal administrasjon, overvåke kliniske parametere forbundet med sykdom pathogenesis, og utnytte bronchoalveolar lavage væske til å evaluere vertens immunrespons. De teknikkene som beskriveser allment gjeldende for å studere verts medfødte immunforsvar til et mangfoldig utvalg av PAMPs og patogener. På samme måte, med mindre modifikasjoner, er disse teknikker kan også bli anvendt i studier evaluere allergisk luftveisinflammasjon og i farmakologiske anvendelser.
Introduction
Lungeinfeksjoner i forbindelse med sykdomsfremkallende bakterier arter er en vanlig årsak til global sykelighet og dødelighet. Avgjøre hvilke mekanismer som driver vertens immunrespons mot disse patogener vil fremme utviklingen av nye forebyggende strategier og terapeutiske midler som vil dempe virkningen av disse infeksjonene. Det overordnede målet i protokollen er beskrevet her, er å gi brukeren en fleksibel metode for å evaluere verts medfødte immunrespons mot patogen infeksjon ved hjelp av et patogen assosiert molekylær mønster (PAMP) som et surrogat for levende bakterier. Flertallet av tidligere studier som evaluerte verten medfødte immunrespons mot bakterier har fokusert på peritoneal modeller på grunn av den relativt enkelt gjennomføring. Selv om disse modellene er meget nyttige og har resultert i betydelige fremskritt innen host-patogen interaksjoner og systemisk inflammasjon, data generert fra disse modellene er ikke alltid hensiktsmessig for studier involving luftveiene. Her blir en lungemodell for akutt lungebetennelse foreslått som en praktisk og klinisk relevant ekspansjon av de klassiske intraperitoneal (ip) injeksjon modeller. Den foreslåtte teknikk gjør det mulig for den lokale vurdering av den medfødte immunrespons hos et organ bestemt modellsystem.
Metodene som beskrives her, er utformet for å tilveiebringe en enkel og robust teknikk for å tillate brukere å evaluere vertens immunrespons overfor LPS, som er en vanlig PAMP. Metodene er basert på intratrakeal (it) instillasjon av LPS, som induserer en sterk medfødte immunrespons i lungene til mus og etterligner mange av de patofysiologiske funksjoner observert i humane pasienter som lider av respiratoriske infeksjoner og akutt lungeskade 1.. Den viktigste fordelen med denne teknikken er at den tillater brukeren å evaluere vertens immunrespons uten konfunderende faktorer og sikkerhetsmessige bekymringer knyttet til å gjennomføre in vivo studierved hjelp av levende bakterier. Likeledes har det i munnhule og svelg administrering svei beskrevet i denne protokollen betydelige fordeler i forhold til andre vanlig anvendte teknikker, inkludert intranasal (i) administrering og kirurgisk det administrering. For eksempel lar orofaryngeal det administrasjonen relativt nøyaktig en doserings og lungedeponering i forhold til i administrasjonen, som vanligvis lider av økt variabilitet av lungedeponering på grunn av tap av agenter i nesehulen og bihuler 2-4. Den det tilførselsvei omgår disse hulrom og gir direkte tilgang til luftrøret og luftveier. Likeledes er det kirurgiske det opplegget betydelig mer morbid administrasjon metode og krever omfattende opplæring for å mestre. Protokollene er beskrevet her også inneholde en beskrivelse de vanligste teknikkene og surrogatmarkører som brukes til å evaluere betennelse progresjon og avslutte med en protokoll som beskriver de riktige teknikkene for å forberede luNGS for histopatologi vurderinger. Disse protokollene er fokusert på å minimere antall mus som kreves for hver studie ved å maksimere data generert fra hvert enkelt dyr.
Protokollene er beskrevet er svært fleksibel og kan lett modifisert for å evaluere et variert spekter PAMPs og skader forbundet molekylære mønstre (demper). Videre med noen ytterligere endringer, disse protokollene kan også brukes til studier som evaluerte allergisk luftveissykdomsprogresjon eller host-patogen interaksjoner med levende bakterier, virus eller sopp 5-10.
Protocol
Representative Results
Discussion
De mest kritiske trinnene for vellykket evaluering av vertens immunrespons hos mus lungene er som følger: 1) velge riktig mus belastning og sex for modellen blir vurdert; 2) optimalisere PAMP levering til lungene; 3) riktig samle inn og behandle Balf; og 4) skal fikse og forberede av lungene for histopatologiske vurderinger.
Valget av musestamme er en viktig faktor i å vurdere vertens immunrespons. C57Bl / 6 mus er vanligvis ansett som den optimale muse bakgrunn for å studere medfødt imm…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker VA-MD Regional College of Veterinary Medicine for å gi kjernen og teknisk støtte for dette prosjektet. Dette arbeidet støttes av en NIH Career Development Award (K01DK092355).
Materials
| C57Bl/6J | The Jackson Laboratory | Stock 000664 |
| Compact Scale | Ohaus Scale Corporation | 71142845 |
| Small Animal Rectal Thermometer | Braintree Scientific | TH 5 |
| Rectal Probe for Rodents | Braintree Scientific | RET 3 |
| Ear Punch | Braintree Scientific | EP-S 901 |
| Lipopolysaccharide from E. coli 0111:B4 | InvivoGen | LPS-EB |
| 1x Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-023 |
| Isoflurane | Baxter | 40032609 |
| Intratrachael Administration and Lung Inflation Stand | ICAP Manufacturing | n/a |
| Rodent Intubation Stand | Braintree Scientific | RIS 100 |
| Scissors (blunt/sharp) | Fisher Scientific | 13-806-2 |
| forceps (straight) | Fisher Scientific | 22-327-379 |
| forceps (45º, curved) | Fisher Scientific | 10-275 |
| Scissors (blunt/blunt) | Fisher Scientific | 08-940 |
| Pipette (200 µl Capacity) | Gilson | F123601 |
| Ethanol | Sigma | 459844 |
| 1 ml Syringe | BD Medical | 301025 |
| 10 ml Syringe | BD Medical | 301604 |
| 27 G x 0.5 in. needle | BD Medical | 305109 |
| Refrigerated Microcentrifuge | Fisher Scientific | 13-100-676 |
| 1.2 mm Tracheal Cannulae with Luer-adapter | Harvard Apparatus | 732836 |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-076 |
| 4-0 Silk Braided Surgical Suture | Ethicon | A183 |
| Luer to Tube Connector Kits | Harvard Apparatus | 721406 |
| Luer Stopcock Kit | Harvard Apparatus | 721664 |
| Tygon formula E-3603 laboratory tubing | Sigma | R-3603 |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501128-4L |
| Mouse IL-1β OptEIA ELISA Kit | BD Biosciences | 559603 |
| Mouse IL-6 OptEIA ELISA Kit | BD Biosciences | 550950 |
| Mouse TNF-α OptEIA ELISA Kit | BD Biosciences | 560478 |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 3520 |
| Hemacytometer Cover Glasses | Thermo Scientific | 22-021-801 |
| Trypan Blue | Thermo Scientific | SV3008401 |
| Cytology Funel Clips | Fisher Scientific | 10-357 |
| Cytology Funels | Fisher Scientific | 10-354 |
| Filter Cards | Fisher Scientific | 22-030-410 |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-1 |
| Cover Glasses | Fisher Scientific | 12-540A |
| Cytospin Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 |
| Diff Quick Staining Kit | Fisher Scientific | 47733150 |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-500 |
References
- Matute-Bello, G., et al. An official American Thoracic Society workshop report: features and measurements of experimental acute lung injury in animals. Am. J. respir. Cell Mol. Biol. 44, 725-738 (2011).
- Egger, C., et al. Administration of bleomycin via the oropharyngeal aspiration route leads to sustained lung fibrosis in mice and rats as quantified by UTE-MRI and histology. PloS one. 8, (2013).
- Rayamajhi, M., et al. Nonsurgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry. J. Vis. Exp. , (2011).
- Revelli, D. A., Boylan, J. A., Gherardini, F. C. A non-invasive intratracheal inoculation method for the study of pulmonary melioidosis. Front. Cell. Infect. Microbiol. 2, 164 (2012).
- Allen, I. C., et al. Analysis of NLRP3 in the development of allergic airway disease in mice. J. Immunol. 188, 2884-2893 (2012).
- Allen, I. C., et al. Characterization of NLRP12 during the in vivo host immune response to Klebsiella pneumoniae and Mycobacterium tuberculosis. PloS one. , (2013).
- Allen, I. C., et al. Expression and function of NPSR1/GPRA in the lung before and after induction of asthma-like disease. Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 291, 1005-1017 (2006).
- Kebaier, C., et al. Staphylococcus aureus alpha-hemolysin mediates virulence in a murine model of severe pneumonia through activation of the NLRP3 inflammasome. J. Infect. Dis. 205, 807-817 (2012).
- Roberts, R. A., et al. Analysis of the murine immune response to pulmonary delivery of precisely fabricated nano- and microscale particles. PloS one. 8, (2013).
- Willingham, S. B., et al. NLRP3 (NALP3, Cryopyrin) facilitates in vivo caspase-1 activation, necrosis, and HMGB1 release via inflammasome-dependent and -independent pathways. J. Immunol. 183, 2008-2015 (2009).
- Kline, J. N., et al. Variable airway responsiveness to inhaled lipopolysaccharide. Am. J. Respir. Crit. Med. 160, 297-303 (1999).
- Cressman, V. L., Hicks, E. M., Funkhouser, W. K., Backlund, D. C., Koller, B. H. The relationship of chronic mucin secretion to airway disease in normal and CFTR-deficient mice. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 19, 853-866 (1998).
