A utilização de orofaringe Intratraqueal Administração PAMP e Lavagem Broncoalveolar para avaliar a resposta imune do hospedeiro em camundongos
Summary
A resposta imune do hospedeiro à infecção do agente patogénico é um processo fortemente regulado. Utilizando um modelo de exposição do pulmão lipopolissacarídeo em ratos, é possível realizar avaliações de alta resolução dos complexos mecanismos associados à patogênese da doença.
Abstract
A resposta imune do hospedeiro contra patógenos é um processo biológico complexo. A maioria dos estudos in vivo classicamente utilizada para caracterizar as interações patógeno-hospedeiro tirar proveito de injeções intraperitoneais de selecionar bactérias ou padrões moleculares de patógenos associados (PAMPs) em camundongos. Embora essas técnicas têm rendido dados tremendos associados pathobiology doença infecciosa, os modelos de injeção intraperitoneal nem sempre são adequados para estudos de interação patógeno-hospedeiro no pulmão. Utilizando um modelo de inflamação pulmonar aguda em ratos, é possível realizar uma análise de alta resolução do anfitrião resposta imune inata utilizando lipopolissacarídeo (LPS). Aqui, descrevemos os métodos para administrar LPS usando administração intratraqueal orofaríngea não cirúrgico, monitorar parâmetros clínicos associados com a patogênese da doença, e utilizar lavado broncoalveolar para avaliar a resposta imune do hospedeiro. As técnicas que estão descritassão amplamente aplicáveis para o estudo da resposta imune do hospedeiro inata de uma gama diversificada de PAMPs e patógenos. Da mesma forma, com pequenas modificações, estas técnicas também podem ser aplicados em estudos que avaliam a inflamação alérgica das vias aéreas e em aplicações farmacológicas.
Introduction
As infecções pulmonares associadas com espécies de bactérias patogênicas são uma causa comum de morbidade e mortalidade global. Determinar os mecanismos que impulsionam a resposta imune do hospedeiro para estes patógenos vai promover o desenvolvimento de novas estratégias de prevenção e agentes terapêuticos que atenuam o impacto destas infecções. O objetivo geral do protocolo descrito aqui é fornecer ao usuário um método flexível para avaliar o anfitrião resposta imune inata à infecção do patógeno usando um associado padrão molecular de patógenos (PAMP) como um substituto para bactérias vivas. A maioria dos estudos anteriores que avaliaram a resposta imune do hospedeiro natural para as bactérias têm-se centrado em modelos peritoneal devido à relativa facilidade de execução. Embora estes modelos são muito úteis e têm resultado em avanços significativos no campo das interações patógeno-hospedeiro e inflamação sistêmica, os dados gerados a partir desses modelos nem sempre são adequadas para estudos involving do sistema respiratório. Aqui, um modelo pulmonar de inflamação pulmonar aguda é proposto como uma expansão prático e clinicamente relevante dos intraperitoneal (ip) de injeção de modelos clássicos. A técnica proposta permite a avaliação local da resposta imune inata em um sistema modelo específico do órgão.
Os métodos descritos aqui são projetados para fornecer uma técnica simples e robusta para permitir que os usuários para avaliar a resposta imune do hospedeiro ao LPS, que é um PAMP comum. Os métodos baseiam-se na via intratraqueal (it) instilação de LPS, que induz uma resposta imune inata robusta nos pulmões dos ratos e imita muitas das características fisiopatológicas observadas em pacientes humanos que sofrem de infecções respiratórias e lesão pulmonar aguda 1. A principal vantagem desta técnica é que ela permite ao usuário avaliar a resposta imune do hospedeiro, sem os fatores de confusão e problemas de segurança associados à realização de estudos in vivoutilizando bactérias vivas. Do mesmo modo, a via de administração que orofaríngea de exposição descrito neste processo tem vantagens significativas sobre outras técnicas geralmente utilizadas, incluindo intranasal (em) a administração e que a administração cirúrgica. Por exemplo, ele permite que a dosagem de administração orofaríngea relativamente preciso e deposição nos pulmões em comparação com a administração, que normalmente sofre de um aumento da variabilidade da deposição nos pulmões, devido à perda de agentes na cavidade nasal e os seios 2-4. A rota que contorna administração destas cavidades e permite acesso direto à traquéia e vias aéreas. Da mesma forma, a abordagem cirúrgica que é um método de administração significativamente mais mórbida e requer extenso treinamento para dominar. Os protocolos descritos aqui também incluir uma descrição das técnicas comuns e marcadores substitutos utilizados para avaliar a progressão da inflamação e termina com um protocolo descrevendo as técnicas apropriadas para a preparação da lungs para avaliações de histopatologia. Estes protocolos são focados em minimizar o número de ratinhos necessários para cada estudo, maximizando os dados gerados a partir de cada animal.
Os protocolos descritos são altamente flexível e pode ser facilmente modificado para avaliar uma diversificada gama PAMPs e padrões moleculares danos associados (amortece). Além disso, com algumas modificações adicionais, estes protocolos podem também ser aplicadas a estudos de avaliação das vias aéreas alérgica progressão da doença ou interações patógeno-hospedeiro com bactérias vivas, vírus ou fungos 5-10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os passos mais críticos para avaliar com sucesso a resposta imune do hospedeiro no pulmão do rato é a seguinte: 1) escolher a tensão do mouse apropriado e sexo para o modelo que está sendo avaliado; 2) otimizar a entrega PAMP para os pulmões; 3) coletar e processar corretamente o LBA; e 4) devidamente corrigir e preparar os pulmões para avaliações histopatológicas.
A escolha do rato tensão é um fator importante na avaliação da resposta imune do hospedeiro. C57BL / 6 são tipica…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem a Faculdade Regional VA-MD da medicina veterinária para a prestação de núcleo e suporte técnico para este projeto. Este trabalho é apoiado por uma NIH Career Award Desenvolvimento (K01DK092355).
Materials
| C57Bl/6J | The Jackson Laboratory | Stock 000664 |
| Compact Scale | Ohaus Scale Corporation | 71142845 |
| Small Animal Rectal Thermometer | Braintree Scientific | TH 5 |
| Rectal Probe for Rodents | Braintree Scientific | RET 3 |
| Ear Punch | Braintree Scientific | EP-S 901 |
| Lipopolysaccharide from E. coli 0111:B4 | InvivoGen | LPS-EB |
| 1x Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-023 |
| Isoflurane | Baxter | 40032609 |
| Intratrachael Administration and Lung Inflation Stand | ICAP Manufacturing | n/a |
| Rodent Intubation Stand | Braintree Scientific | RIS 100 |
| Scissors (blunt/sharp) | Fisher Scientific | 13-806-2 |
| forceps (straight) | Fisher Scientific | 22-327-379 |
| forceps (45º, curved) | Fisher Scientific | 10-275 |
| Scissors (blunt/blunt) | Fisher Scientific | 08-940 |
| Pipette (200 µl Capacity) | Gilson | F123601 |
| Ethanol | Sigma | 459844 |
| 1 ml Syringe | BD Medical | 301025 |
| 10 ml Syringe | BD Medical | 301604 |
| 27 G x 0.5 in. needle | BD Medical | 305109 |
| Refrigerated Microcentrifuge | Fisher Scientific | 13-100-676 |
| 1.2 mm Tracheal Cannulae with Luer-adapter | Harvard Apparatus | 732836 |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-076 |
| 4-0 Silk Braided Surgical Suture | Ethicon | A183 |
| Luer to Tube Connector Kits | Harvard Apparatus | 721406 |
| Luer Stopcock Kit | Harvard Apparatus | 721664 |
| Tygon formula E-3603 laboratory tubing | Sigma | R-3603 |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501128-4L |
| Mouse IL-1β OptEIA ELISA Kit | BD Biosciences | 559603 |
| Mouse IL-6 OptEIA ELISA Kit | BD Biosciences | 550950 |
| Mouse TNF-α OptEIA ELISA Kit | BD Biosciences | 560478 |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 3520 |
| Hemacytometer Cover Glasses | Thermo Scientific | 22-021-801 |
| Trypan Blue | Thermo Scientific | SV3008401 |
| Cytology Funel Clips | Fisher Scientific | 10-357 |
| Cytology Funels | Fisher Scientific | 10-354 |
| Filter Cards | Fisher Scientific | 22-030-410 |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-1 |
| Cover Glasses | Fisher Scientific | 12-540A |
| Cytospin Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 |
| Diff Quick Staining Kit | Fisher Scientific | 47733150 |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-500 |
References
- Matute-Bello, G., et al. An official American Thoracic Society workshop report: features and measurements of experimental acute lung injury in animals. Am. J. respir. Cell Mol. Biol. 44, 725-738 (2011).
- Egger, C., et al. Administration of bleomycin via the oropharyngeal aspiration route leads to sustained lung fibrosis in mice and rats as quantified by UTE-MRI and histology. PloS one. 8, (2013).
- Rayamajhi, M., et al. Nonsurgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry. J. Vis. Exp. , (2011).
- Revelli, D. A., Boylan, J. A., Gherardini, F. C. A non-invasive intratracheal inoculation method for the study of pulmonary melioidosis. Front. Cell. Infect. Microbiol. 2, 164 (2012).
- Allen, I. C., et al. Analysis of NLRP3 in the development of allergic airway disease in mice. J. Immunol. 188, 2884-2893 (2012).
- Allen, I. C., et al. Characterization of NLRP12 during the in vivo host immune response to Klebsiella pneumoniae and Mycobacterium tuberculosis. PloS one. , (2013).
- Allen, I. C., et al. Expression and function of NPSR1/GPRA in the lung before and after induction of asthma-like disease. Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 291, 1005-1017 (2006).
- Kebaier, C., et al. Staphylococcus aureus alpha-hemolysin mediates virulence in a murine model of severe pneumonia through activation of the NLRP3 inflammasome. J. Infect. Dis. 205, 807-817 (2012).
- Roberts, R. A., et al. Analysis of the murine immune response to pulmonary delivery of precisely fabricated nano- and microscale particles. PloS one. 8, (2013).
- Willingham, S. B., et al. NLRP3 (NALP3, Cryopyrin) facilitates in vivo caspase-1 activation, necrosis, and HMGB1 release via inflammasome-dependent and -independent pathways. J. Immunol. 183, 2008-2015 (2009).
- Kline, J. N., et al. Variable airway responsiveness to inhaled lipopolysaccharide. Am. J. Respir. Crit. Med. 160, 297-303 (1999).
- Cressman, V. L., Hicks, E. M., Funkhouser, W. K., Backlund, D. C., Koller, B. H. The relationship of chronic mucin secretion to airway disease in normal and CFTR-deficient mice. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 19, 853-866 (1998).
