L'utilisation de l'oropharynx Intratrachéal PAMP administration et lavage broncho-alvéolaire pour évaluer l'hôte une réaction immunitaire chez la souris

Summary

La réponse immunitaire de l'hôte à l'infection par des pathogènes est un processus étroitement régulé. Utilisant un poumon modèle d'exposition de lipopolysaccharide chez la souris, il est possible de procéder à des évaluations de haute résolution des mécanismes complexes associés à la pathogenèse de la maladie.

Abstract

La réponse immunitaire de l'hôte à des agents pathogènes est un processus biologique complexe. La majorité des études in vivo utilisé classiquement pour caractériser les interactions hôte-pathogène profiter des injections intra-péritonéales de sélectionner des bactéries ou des motifs moléculaires de pathogènes associés (PAMP) chez la souris. Bien que ces techniques ont donné des données énormes liés à pathobiology des maladies infectieuses, les modèles d'injection intrapéritonéale sont pas toujours appropriés pour les études d'interaction hôte-pathogène dans les poumons. Utilisant un modèle d'inflammation pulmonaire aiguë chez la souris, il est possible de procéder à une analyse à haute résolution de l'hôte réponse immunitaire innée utilisant le lipopolysaccharide (LPS). Ici, nous décrivons les méthodes d'administration de LPS en utilisant non chirurgicale administration intratrachéale oropharyngée, de surveiller les paramètres cliniques associés à la pathogenèse de la maladie, et d'utiliser le liquide de lavage broncho-alvéolaire pour évaluer la réponse immunitaire de l'hôte. Les techniques qui sont décritessont largement applicable pour l'étude de la réponse immunitaire innée hôte à un large éventail de PAMP et les agents pathogènes. De même, avec des modifications mineures, ces techniques peuvent également être appliquées dans des études évaluant l'inflammation allergique des voies aériennes et dans des applications pharmacologiques.

Introduction

Les infections pulmonaires associés aux espèces de bactéries pathogènes sont une cause fréquente de morbidité et de mortalité dans le monde. Déterminer les mécanismes qui conduisent la réponse immunitaire de l'hôte à ces agents pathogènes favorisera le développement de nouvelles stratégies de prévention et des agents thérapeutiques qui atténuent l'impact de ces infections. L'objectif global du protocole décrit ici est de fournir à l'utilisateur une méthode flexible pour évaluer l'hôte réponse immunitaire innée à l'infection par des agents pathogènes en utilisant un modèle de l'agent pathogène associé moléculaire (PAMP) comme un substitut p....

Protocol

Toutes les études ont été menées sous l'approbation du Comité des soins et institutionnel (IACUC) pour Virginia Tech et en conformité avec les National Institutes of Health Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire.

Une. Intratrachéale (it) inoculation de LPS aide de l'Administration de l'oropharynx

1. Assurez-vous que chaque animal est identifié en utilisant soit un coup de poing de l'oreille, une étiquette d'oreille, ou toute autre méthode approuvée institutionnellement.
2. Noter le poids corporel de base et la température du corps de chaque animal.
3. Préparer le ....

Results

Les parois cellulaires des bactéries Gram-négatives sont constituées de LPS, ce qui est très abondant dans l'environnement. L'inhalation de LPS dans les populations humaines sensibles exacerbe réactivité des voies respiratoires et est capable de déclencher une response11 immunitaire robuste. LPS est également un PAMP commun utilisé dans des modèles de souris pour induire une réponse immunitaire innée robuste. Dans le protocole décrit ici, les souris ont reçu une dose de LPS il isolé de E. coli (sérotype 0111: B.......

Discussion

Les étapes les plus critiques pour l'évaluation avec succès la réponse immunitaire de l'hôte dans les poumons de souris est comme suit: 1) choisir la souche de souris approprié et le sexe pour le modèle en cours d'évaluation; 2) optimiser la livraison de PAMP pour les poumons; 3) recueillir et traiter correctement la BALF; et 4) fixer correctement et préparer des poumons pour l'évaluation histopathologique.

Le choix de la souche de souris est un facteur important dans l'é.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57Bl/6J	The Jackson Laboratory	Stock 000664
Balance compacte	Ohaus Scale Corporation	71142845
Thermomètre rectal pour petits animaux	Braintree Scientific	TH 5
Sonde rectale pour rongeurs	Braintree Scientific	RET 3
Ear Punch	Braintree Scientific	EP-S 901
Lipopolysaccharide de E. coli 0111 :B4	InvivoGen	LPS-EB
1x Phosphate Buffered Saline	Life Technologies	10010-023
Isoflurane	Baxter	40032609
Intratrachael Administration et gonflage pulmonaire Stand	ICAP Manufacturing	n/a
Stand d’intubation de rongeurs	Braintree Scientific	RIS 100
Ciseaux (émoussés/tranchants)	Fisher Scientific	13-806-2
pinces (droites)	Fisher Scientific	22-327-379
pinces (45º ;, courbes)	Fisher Scientific	10-275
Ciseaux (émoussés/émoussés)	Fisher Scientific	08-940
Pipette (200 µ ; l Capacité)	Gilson	F123601
Ethanol	Sigma	459844
Seringue de 1 ml	BD Medical	301025
Seringue de 10 ml	BD Medical	301604
27 g x 0,5 po		305109 Fisher
	Scientific	13-100-676
Canules trachéales de 1,2 mm avec adaptateur Luer	Appareil Harvard	732836
Hank’s Balanced Salt Solution	Life Technologies	14025-076
Suture chirurgicale tressée en soie 4-0	Ethicon	A183
Kits de connecteur Luer à tube	Appareil Harvard	721406
Kit Luer Stopcock Appareil	Harvard	721664
Tygon formula E-3603 Tubulure de laboratoire	Sigma	R-3603
Solution de formol, tamponnée neutre, 10 %	Sigma	HT501128-4L
Souris IL-1&beta ; OptEIA ELISA Kit	BD Biosciences	559603
souris IL-6 OptEIA Kit ELISA	BD Biosciences	550950
souris TNF-&alpha ; OptEIA ELISA Kit	BD Biosciences	560478
Hémocytomètre	Hausser Scientific	3520
Hémocytomètre Lunettes de protection	Thermo Scientific	22-021-801
Trypan Blue	Thermo Scientific	SV3008401
Clips d’entonnoir de cytologie	Fisher Scientific	10-357
Entonnoirs de cytologie	Fisher Scientific	10-354
Cartes filtres	Fisher Scientific	22-030-410
Lames de microscope	Fisher Scientific	12-544-1
Lunettes de protection	Fisher Scientific	12-540A
Cytospin Cytocentrifuge	Thermo Scientific	A78300003
Diff Kit de coloration rapide	Fisher Scientific
Permount Support de montage	Fisher Scientific	SP15-500