Иммуногистохимические и кальция способы визуализации в Wholemount сетчатке крыс
Summary
Протоколы Иммуногистохимия используются для изучения локализации специфического белка в сетчатке. Методы визуализации кальция используются для изучения динамики кальция в ганглиозных клеток сетчатки и их аксонов.
Abstract
В этой статье мы опишем инструменты, реактивы и практические шаги, которые необходимы для: 1) успешной подготовки Wholemount сетчатки для иммуногистохимии и, 2) изображения кальция для изучения напряжения закрытого кальциевых каналов (VGCC) передачи сигналов кальция в сетчатке глаза ганглиозные клетки. Метод визуализации кальция мы описываем обходит вопросы, касающиеся неспецифическую нагрузку перемещенных амакринных клеток в слое ганглиозных клеток.
Introduction
Ганглиозных клеток сетчатки (РГК) выразить L-, N-, P / Q-и Т-типа VGCC как определено с помощью лекарственных препаратов блокады этих компонентов всей клетки Калифорния Channel ток 1,2. VGCC являются трансмембранными мультимерные белки, которые участвуют в выпуске передатчика, транскрипции генов, регуляции клеточного и синаптической пластичности 3,4,5. Функциональные VGCCs состоят как минимум из трех различных классов субъединиц: крупные, трансмембранных α 1 пор формирования подразделений, которые устанавливают биофизические и фармакологические свойства канала, в первую очередь внеклеточного вспомогательный α 2 δ субъединицы и внутриклеточные β субъединиц. Последние два форма гетеромерные комплексы с различными α 1 субъединицы и изменять литниковые кинетики и оборота каналов в мембране 6.
За последние десятилетия, многие методы были использованы для изучения белка Expreделения, такие как иммуногистохимии, иммуноферментного анализа, вестерн-анализа и проточной цитометрии. Эти методы требуют использования специфических антител для обнаружения данного белка, представляющего интерес, и обеспечивают мощный инструмент для локализации и распределения специфических белков в различных тканях. Методы, используемые для обнаружения и количественной оценки уровней экспрессии мРНК того или иного белка, такие как Нозерн-блот анализ, ОТ-ПЦР в режиме реального времени количественный ПЦР, гибридизация, кДНК-микрочипов и защиты рибонуклеазы анализа обеспечивают альтернативный подход, когда антитела не являются легко отсутствует или если уровни экспрессии конкретного белка низки 7. Тем не менее, одно ограничение на использование таких молекулярных методов является искомым идентификации последовательности гена.
Для локализации белков в сетчатке, иммуногистохимия может быть выполнена на Wholemount сетчатки. В связи с доступностью РГК, в Wholemountподготовка обеспечивает отличную платформу для изучения локализации специфических белков в somata РГК и их аксонов.
В дополнение к их локализации, некоторые функциональные свойства VGCCs в РСК может быть продемонстрирована путем использования методов визуализации кальция. Мы опишем протокол визуализации кальция выборочно маркировать РГК с индикатора кальция красителя для измерения динамики внутриклеточного кальция. Вклад различных VGCCs к сигналу кальция в различных клеточных компартментах, могут быть выделены с использованием специфических подтипов антагонистов кальция.
Возможно, одним из самых выгодных аспектов техники изображающего кальция, описанного здесь является способность одновременно и независимо записывать с нескольких РГК и их аксонов. Хотя многие физиологические методы, такие как всей записи зажима клеток патч, обеспечивают высокие временные записи разрешением мембранных токов, соматических или аксонов источник Фесе токи, записанные не может быть подвергнут дискриминации и записи могут быть сделаны только из одного нейрона в то время. Многоэлектродная массивы (МПС) способны одновременно записывать шипы из многих клетках, но не может ни обнаружить, ни дискриминации активацию, например, различных подтипов кальциевых каналов. МЭС преимущественно записывать из клеток, которые расположены в непосредственной близости от данного электрода 8 и записи из клеток, которые генерируют большие шипы 9. Методы оптических изображений обеспечивают альтернативную стратегию, с тем чтобы одновременные и независимые записи целых популяций клеток, которые могут быть интегрированы с информацией, полученной от одного микроэлектродом клеток и записи зажима патч и записи MEA. Хотя методы визуализации кальция, описанные здесь, были использованы для изучения динамики кальциевые РСК, патч зажим и МПС также могут быть использованы параллельно, чтобы дальнейшее выявление ионные токи и пики свойства РСК.
<pкласс = "jove_content"> С перемещенных амакринные клетки составляют около 60% нейронов населения в слое ганглиозных клеток у мышей сетчатки 10, наша цель в том, чтобы использовать загрузочную технику, которая избирательно маркирует РГК с индикатора синтетического кальция красителя в Wholemount подготовка. Хотя синтетические красители индикатор кальция обеспечивают отличную платформу для изучения динамики внутриклеточного кальция, его широкое использование было затруднено невозможностью эффективно загружать определенные популяции нейронов в данной сети. Многие методы, такие как массовой загрузки 11 и электропорации 8,12 были выполнены, чтобы загрузить целые популяции клеток, однако, такие методы не различают специфические типы клеток. Генетически кодируемых показатели кальция обеспечивают возможность выборочно маркировать определенные популяции клеток, однако, такие методы требуют генерации трансгенных животных 13. Наша методика описывает метод избирательно маркировать РГК в Wholemount подготовки через зрительного инъекции нервных культи индикатора кальция красителя.Взятые вместе, структурные и физиологические методы, изложенные в этой статье обеспечить платформу для изучения локализации и вклад VGCCs до сигнала кальция в РГК и их аксонов.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой статье мы описали два различных методов: 1) Иммуногистохимия чтобы показать Fluo-4 локализацию к ганглиозных клеток в сетчатке глаза wholemounts, и 2) визуализации кальция для анализа динамики кальция в ганглиозных клеток сетчатки и их аксонов.
Иммуногистохимия помощью whol…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим д-р С. Стелла и Хелен Vuong за вклад в протоколе изображений кальция. Мы благодарим д-р К. листы для съемок интервью сцены. Мы благодарим доктора Арлин Хирано за ее замечания по рукописи. Этот проект исследования и разработки было проведено авторами на Дэвида Geffen Школа медицины при Калифорнийском университете и стало возможным благодаря договору подряда, который был удостоен и ведении армии США медицинских исследований и Команда матчасти (USAMRMC) и Телемедицина и Advanced Technology Научно-исследовательский центр (TATRC), в Форт Детрике, MD под номер контракта: W81XWH-10-2-0077. Поддержка этих исследований также пришел из NIH EY04067 и заслуги Review В.А. (NB). НКО является В.А. Карьера научный.
Materials
| Straight scissors | WPI | 14124-G | dissecting tools |
| Straight Forceps | WPI | 501985 | dissecting tools |
| curved iris scissors | WPI | 504487 | dissecting tools |
| Cellulose filter paper | Millipore | HABP04700 | |
| Hibernate A | Invitrogen | A12475-01 | Media |
| Vectashield | Vector | H-1000 | Mounting Media for Fluorescence |
| Fluo-4 pentapotassium | Invitrogen | F-14200 | |
| Isoflurane | Abbott Laboratories | 05260-05 | anesthesia |
| Microscope slide | Fisher Scientific | 22-178-277 | |
| Zeiss LSM 5 Pascal microscope | Zeiss | ||
| Axioplan 40x (NA 0.8) objective lens | Zeiss | ||
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Molecular Probes | A-11034 | Secondary antibody |
| RBPMS | ProSci, Poway, CA | A rabbit polyclonal antibody was generated against the N-terminus of the RBPMS polypeptide (RBPMS4-24), GGKAEKENTPSEANLQEEEVR, by a commercial vendor (ProSci, Poway, CA). |
References
- Guenther, E., et al. Separation of calcium currents in retinal ganglion cells from postnatal rat. Brain Res. 633, 223-235 (1994).
- Farrell, S. R., et al. Modulation of voltage-gated ion channels in rat retinal ganglion cells mediated by somatostatin receptor subtype 4. J Neurophysiol. 104, 1347-1354 (2010).
- Caterall, W. A. Structure and regulation of voltage-gated Ca2+ channels. Annu Rev Cell Dev Biol. 16, 521-555 (2000).
- Berridge, M. J., et al. Calcium–a life and death signal. Nature. 395, 645-648 (1998).
- Berridge, M. J. Calcium microdomains Organization and function. Cell Calcium. 40, 405-412 (2006).
- Dolphin, A. C. Calcium channel diversity multiple roles of calcium channel subunits. Curr Opin Neurobiol. 19, 237-244 (2009).
- Rottman, J. B. The ribonuclease protection assay a powerful tool for the veterinary pathologist. Vet Pathol. 39, 2-9 (2002).
- Briggman, K. L., Euler, T. Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina. J Neurophysiol. 105, 2601-2609 (2011).
- Segev, R., et al. Recording spikes from a large fraction of the ganglion cells in a retinal patch. Nat Neurosci. 7, 1154-1161 (2004).
- Jeon, C. J., et al. The major cell populations of the mouse retina. J Neurosci. 18, 8936-8946 (1998).
- Blankenship, A. G., et al. Synaptic and extrasynaptic factors governing glutamatergic retinal waves. Neuron. 62, 230-241 (2009).
- Daniels, B. A., Baldridge, W. H. d-Serine enhancement of NMDA receptor-mediated calcium increases in rat retinal ganglion cells. J Neurochem. 112, 1180-1189 (2010).
- Weitz, A. C., et al. Imaging the response of the retina to electrical stimulation with genetically encoded calcium indicators. J Neurophysiol. 109, 1979-1988 (2013).
- Pérez de Sevilla Müller, L., et al. Expression of voltage-gated calcium channel α(2)δ(4) subunits in the mouse and rat retina. J Comp Neurol. 521 (2), 2486-2501 (2013).
- Hirano, A. A., et al. SNAP25 expression in mammalian retinal horizontal cells. J Comp Neurol. 519, 972-988 (2011).
- Berridge, M. J., et al. Calcium signalling dynamics, homeostasis and remodeling. Nat Rev Mol Cell Biol. 4, 517-529 (2003).
- Dailey, M. E., et al. Maintaining live cells and tissue slices in the imaging setup. Cold Spring Harb ProtocI. , 373-379 (2011).
- Spinelli, K. J., Gillespie, P. G. Monitoring intracellular calcium ion dynamics in hair cell populations with Fluo-4. AM. PLoS One. 7, e51874 (2012).
- Kwong, J. M. K., et al. RNA binding protein with multiple splicing A new marker for retinal ganglion cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 1052-1058 (2010).
- Pérez deSevilla Müller, L., et al. Displaced amacrine cells of the mouse retina. J Comp Neurol. 505, 177-189 (2007).
- Pérez de Sevilla Müller, L., et al. Tracer coupling of intrinsically photosensitive retinal ganglion cells to amacrine cells in the mouse retina. J Comp Neurol. 518, 4813-4824 (2010).
- Raymond, I. D., et al. Cyan fluorescent protein expression in ganglion and amacrine cells in a thy1-CFP transgenic mouse retina. Mol Vis. 14, 1559-1574 (2008).
- Raymond, I. D., et al. A Thy1-CFP DBA/2J mouse line with cyan fluorescent protein expression in retinal ganglion cells. Vis Neurosci. 26, 453-465 (2009).
- Mayer, M. L., Westbrook, G. L. Permeation and block of N-methyl-D-aspartic acid receptor channels by divalent cations in mouse cultured central neurones. J Physiol. 394, 501-527 (1987).
- Ascher, P., Nowak, L. The role of divalent cations in the N-methyl-D-aspartate responses of mouse central neurons in culture. J Physiol. 399, 247-266 (1988).
- Aizenman, E., et al. Responses mediated by excitatory amino acid receptors in solitary retinal ganglion cells from rat. J Physiol. 396, 75-91 (1988).
- Taschenberger, H., et al. Synaptic current kinetics in a solely AMPA-receptor-operated glutamatergic synapse formed by rat retinal ganglion neurons. J Neurophysiol. 74, 1123-1136 (1995).
- Chen, S., Diamond, J. S. Synaptically released glutamate activates extrasynaptic NMDA receptors on cells in the ganglion cell layer of rat retina. J Neurosci. 22, 2165-2173 (2002).
- Jakobs, T. C., et al. Expression of mRNA for glutamate receptor subunits distinguishes the major classes of retinal neurons, but is less specific for individual cell types. Mol Vis. 13, 933-948 (2007).
- Margolis, D. J., Detwiler, P. B. Different mechanisms generate maintained activity in ON and OFF retinal ganglion cells. J NeurosciI. 27, 5994-6005 (2007).
- Margolis, D. J., et al. Dendritic calcium signaling in ON and OFF mouse retinal ganglion cells. J Neurosci. 30, 7127-7138 (2010).
- Baldridge, W. H. Optical recordings of the effects of cholinergic ligands on neurons in the ganglion cell layer of mammalian retina. J Neurosci. 16, 5060-5072 (1996).
- Hartwick, A. T., et al. Functional assessment of glutamate clearance mechanisms in a chronic rat glaucoma model using retinal ganglion cell calcium imaging. J Neurochem. 94, 794-807 (2005).
- Badea, T. C., Nathans, J. Quantitative analysis of neuronal morphologies in the mouse retina visualized by using a genetically directed reporter. J Comp Neurol. 480, 331-351 (2004).
- Huberman, A. D., et al. Architecture and activity-mediated refinement of axonal projections from a mosaic of genetically identified retinal ganglion cells. Neuron. 59, 425-438 (2008).
- Kim, I. J., et al. Molecular identification of a retinal cell type that responds to upward motion. Nature. 452, 478-482 (2008).
- Munch, T. A., et al. Approach sensitivity in the retina processed by a multifunctional neural circuit. Nat Neurosci. 12, 1308-1316 (2009).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
