protocoles d'immunohistochimie sont utilisées pour étudier la localisation d'une protéine spécifique de la rétine. Les techniques d'imagerie de calcium sont utilisés pour étudier la dynamique du calcium dans les cellules ganglionnaires de la rétine et de leurs axones.
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Article de méthode
Immunohistochimie et calcium méthodes d'imagerie dans Wholemount Rat Retina
Dans cet article
Résumé
Résumé
Dans cet article, nous décrivons les outils, les réactifs et les mesures concrètes qui sont nécessaires pour: 1) la préparation réussie de rétines wholemount pour l'immunohistochimie et, 2) l'imagerie calcique pour l'étude de la tension fermée canal de calcium (CCAGV) signalisation médiée de calcium dans la rétine cellules ganglionnaires. Procédé de formation d'image de calcium, nous décrivons des questions relatives au chargement contourne non spécifique de cellules amacrines déplacées dans la couche des cellules ganglionnaires.
Introduction
Les cellules ganglionnaires de la rétine (CGR) expriment L, N, P / Q et T de type CCAGV tel que déterminé par le blocage pharmacologique de ces composants de la cellule entière canal Ca courant 1,2. CCAGV sont des protéines transmembranaires multimères qui sont impliqués dans la libération du transmetteur, la transcription des gènes, régulation cellulaire et la plasticité synaptique 3,4,5. VGCCs fonctionnels sont constitués d'au moins trois catégories distinctes de sous-unités: grandes, une α transmembranaires formant des pores sous-unités qui établissent des propriétés biophysiques et pharmacologiques du canal, principalement ext....
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Protocole
Toutes les expériences ont été réalisées en conformité avec les lignes directrices pour le bien-être des animaux de laboratoire émises par la politique US Public Health Service sur Human Care et l'utilisation des animaux de laboratoire et l'Université de Californie-Los Angeles (UCLA) Comité de recherche animale. Mâle et femelle adultes rats Sprague-Dawley (Charles River Lab, Wilmington, MA) entre l'âge de 3-5 semaines ont été utilisés.
1. animaux et Préparation des tissus pour Wholemount Retina et le Protocole immunohistochimie
- Préparer les matériaux et outils suivants: Une loupe binoculaire, 2 pinces avec des point....
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Résultats
Immunomarquage avec des anticorps spécifiques fournit une plate-forme pour étudier la localisation des protéines d'intérêt particulier dans la rétine et la technique d'imagerie de calcium permet l'étude de la contribution des VGCCs à la dynamique du calcium dans les cellules ganglionnaires de la rétine et de leurs axones.
En utilisant un anticorps dirigé contre les RBPMS de protéines des cellules ganglionnaires (protéine de liaison de l'ARN avec le raccordement multiple) qui .......
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Discussion
Dans cet article, nous avons décrit deux techniques différentes: 1) L'immunohistochimie pour afficher Fluo-4 localisation des cellules ganglionnaires de la rétine dans des échantillons entiers, et 2) l'imagerie de calcium pour analyser la dynamique de calcium dans les cellules ganglionnaires de la rétine et de leurs axones.
L'immunohistochimie en utilisant des échantillons entiers a été utilisé pour révéler la localisation des protéines dans la rétine 20-23 rongeur. Ce.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont aucune divulgation.
Remerciements
Nous remercions le Dr S. Stella et Helen Vuong à contributions pour le protocole d'imagerie de calcium. Nous remercions le Dr K. Feuilles pour filmer les scènes d'entrevue. Nous remercions le Dr Arlene Hirano pour ses commentaires sur le manuscrit. Ce projet de recherche et développement a été menée par les auteurs à la David Geffen School of Medicine à UCLA et est rendu possible par un accord de contrat qui a été attribué et géré par le Commandement de la recherche médicale et du matériel de l'armée américaine (USAMRMC) et la technologie de télémédecine et avancée Centre de recherche (TATRC), à Fort Detrick, dans le Maryland, sous le numéro de contrat: W....
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Ciseaux droits | WPI | 14124-G | Outils de dissection |
| Pince droite | WPI | 501985 | Outils de dissection |
| à iris courbés | de dissection | WPI | 504487 |
| Papier filtre en cellulose | Millipore | HABP04700 | |
| Hibernate A | Invitrogen | A12475-01 | Media |
| Vectashield | Vector | H-1000 | Milieu de montage pour fluorescence |
| Fluo-4 pentapotassique | , Invitrogen | F-14200 | |
| Isoflurane | Abbott Laboratories | 05260-05 | anesthésie |
| lame de microscope | Fisher Scientific | 22-178-277 | |
| Microscope Zeiss LSM 5 Pascal | objectif Zeiss | ||
| Axioplan 40X (NA 0,8) lentille | Zeiss | ||
| Alexa Fluor 488 Chèvre Anti-Lapin IgG (H+L) Anticorps | Sondes moléculaires | A-11034 | Anticorps secondaire |
| RBPMS | ProSci, Poway, CA | A anticorps polyclonal de lapin ; a été généré contre l’extrémité N-terminale du RBPMS ; polypeptide (RBPMS4-24), GGKAEKENTPSEANLQEEEVR, par un fournisseur commercial (ProSci, Poway, CA). |
Références
- Guenther, E., et al. Separation of calcium currents in retinal ganglion cells from postnatal rat. Brain Res. 633, 223-235 (1994).
- Farrell, S. R., et al. Modulation of voltage-gated ion channels in rat retinal ga....
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Réimpressions et autorisations
