Capture spettrometria di massa Compound - un potente strumento per identificare nuovi c-di-GMP effettori Proteine
Summary
The ubiquitous second messenger c-di-GMP controls growth and behavior of many bacteria. We have developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry based technology to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins in virtually any bacterial species.
Abstract
Sono stati compiuti notevoli progressi nel corso degli ultimi dieci anni verso l'identificazione e la caratterizzazione di enzimi coinvolti nella sintesi (ciclasi diguanylate) e di degradazione (fosfodiesterasi) del secondo messaggero c-di-GMP. Al contrario, sono disponibili poche informazioni sui meccanismi molecolari e componenti cellulari attraverso cui questa molecola di segnalazione regolamenta una vasta gamma di processi cellulari. La maggior parte delle proteine effettrici noti appartengono alla famiglia Pilz o sono degenerati ciclasi diguanylate o fosfodiesterasi che hanno rinunciato a catalisi e hanno adottato la funzione effettrici. Così, per definire meglio la rete c-di-GMP cellulare in una vasta gamma di batteri metodi sperimentali sono necessari per identificare e convalidare nuovi effettori che affidabile e in silico previsioni FAIL.
Abbiamo recentemente sviluppato un nuovo Capture spettrometria di massa Compound (CCMS) tecnologia basata come un potente strumento perbiochimicamente identificare e caratterizzare le proteine di legame c-di-GMP. Questa tecnica è stata precedentemente riportato di essere applicabile ad una vasta gamma di organismi 1. Qui diamo una descrizione dettagliata del protocollo che utilizziamo per sondare tali componenti di segnalazione. Come esempio, si usa Pseudomonas aeruginosa, un patogeno opportunista in cui c-di-GMP gioca un ruolo critico nella virulenza e biofilm controllo. CCMS ha identificato il 74% (38/51) dei componenti note o previste della rete c-di-GMP. Questo studio spiega la procedura CCMS in dettaglio, e stabilisce come uno strumento potente e versatile per identificare nuovi componenti coinvolti in piccola molecola di segnalazione.
Introduction
c-di-GMP è una chiave secondo messaggero utilizzato dalla maggior parte dei batteri per controllare vari aspetti della loro crescita e il comportamento. Per esempio, c-di-GMP regola la progressione del ciclo cellulare, la motilità e l'espressione di esopolisaccaridi e adesine superficiali 2-4. Attraverso il coordinamento di tali processi c-di-GMP promuove la formazione di biofilm, un processo che è associata con infezioni croniche di una gamma di batteri patogeni 5. c-di-GMP è sintetizzato da enzimi chiamati ciclasi diguanylate (DGCS) che ospitano un dominio catalitico GGDEF 4. Alcuni DGCS possiedono un sito inibitorio che regola le attività ciclasi su c-di-GMP vincolante. Il degrado di c-di-GMP è catalizzata da due classi distinte di fosfodiesterasi (PDE) che ospitano sia un EAL catalitico o HD-GYP dominio 6,7.
La maggior parte delle proteine effettrici noti che legano direttamente c-di-GMP appartengono a una delle tre classi di proteine: cataliticoGGDEF o EAL domini alleato inattivi e domini Pilz, piccoli interruttori molecolari che subiscono cambiamenti conformazionali su c-di-GMP vincolante 8. DGCS, PDE e Pilz proteine sono ben caratterizzati e loro domini possono essere previsti in silico relativamente sicuro. Un particolare interesse è ora focalizzata sulla identificazione di nuove classi di effettori c-di-GMP. Alcuni effettori c-di-GMP con diversi motivi di legame sono stati descritti recentemente come la CRP / FNR Bcam1349 famiglia di proteine in Burkholderia cenocepacia o FleQ regolatore trascrizionale in P. aeruginosa 9,10. Inoltre, riboswitches GMP-specifici c-di-stati recentemente identificati e indicati per controllare l'espressione genica in modo c-di-GMP-dipendente 11. I motivi c-di-GMP vincolanti di diversi effettori solo sono mal conservati fare previsioni bioinformatici di tali proteine difficile. Per risolvere questo problema, abbiamo sviluppato un metodo biochimico, che si basa sull'utilizzo di una spe c-di-GMPfica Compound Capture combinata con spettrometria di massa 1,12,13.
Abbiamo recentemente abbiamo progettato un nuovo trivalente c-di-GMP Compound Capture (CDG-CC, Figura 1) 1. Questo scaffold chimica è composto da: 1) un residuo c-di-GMP utilizzata come esca per catturare proteine leganti c-di-GMP, 2) un gruppo reattivo UV-fotoattivabile utilizzato per attraversare link CDG-CC alle proteine legate e 3) un biotina per isolare le proteine catturate utilizzando sfere magnetiche rivestite di streptavidina. CDG-CC può essere usato per catturare direttamente e specificamente effettori c-di-GMP dalla miscela complessa di macromolecole come lisati cellulari. Compound Capture basano e approcci proteomica basati chimici sono stati precedentemente segnalati per essere applicabile ad una vasta gamma di organismi, ad esempio Caulobacter crescentus, Salmonella enterica sierotipo typhimurium e P. aeruginosa 1,14.
In questo documento metodologico,forniamo una descrizione in profondità della procedura CCMS utilizzando estratti di P. aeruginosa come esempio. Questo studio stabilisce CCMS come uno strumento potente e versatile per identificare biochimicamente nuovi componenti che praticano la piccola molecola di segnalazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Particolare attenzione dovrebbe essere presa in diverse fasi del protocollo. La concentrazione proteica è un parametro critico con una concentrazione di 10 mg / ml di essere difficile da raggiungere quando le cellule vengono coltivate in condizioni di crescita specifici (ad esempio biofilm o piccole varianti colonia). Così, la risospensione pellet deve essere eseguita in un basso volume di tampone di lisi. Le concentrazioni di proteine possono essere diminuiti di 8 mg / ml. Rispetto al metodo pubblicato…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Alberto Reinders for his work in optimizing the CCMS conditions for P. aeruginosa. We also thank Pablo Manfredifor the annotation of the P. aeruginosa proteins. This work was supported by the Swiss National Science Foundation (SNF) Sinergia grant CRSII3_127433.
Materials
| caproBox | caprotec bioanalytics | 1-5010-001 (220 V) | UV lamps coupled to a cooling 96-plate cooling block, for the photoactivation |
| caproMag | caprotec bioanalytics | included in the CCMS Starter Kit | For easy handling of magnetic particles without pipetting |
| c-di-GMP caproKit | caprotec bioanalytics | upon request | The kit contains the c-di-GMP-capture compound, c-di-GMP (for the competition control), streptavidin coated magnetic beads, capture buffer, and washing buffer |
| Disposable PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| 12-tube PCR strips | Thermo Scientific | AB-1114 | |
| UIS250v sonicator with VialTweeter | Hielscher ultrasound technology | UIS250v and VialTweeter | |
| Miniature French Pressure Cell | Thermo Electron Corporation | FA-003 |
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