Profilering Individuelle humane embryonale stamceller ved kvantitativ RT-PCR
Summary
Enkelt celle genekspression analyse er nødvendig for at forstå stamcelle heterogene.
Abstract
Heterogenitet stamceller befolkning hæmmer detaljeret forståelse af stamceller biologi, såsom deres differentiering tilbøjelighed mod forskellige slægter. En enkelt celle transkriptom assay kan være en ny metode til dissekering individuel variation. Vi har udviklet enkelt celle QRT-PCR-metode, og bekræftede, at denne metode fungerer godt i flere genekspressionsprofiler. I enkelt celle niveau, hver humane embryonale stamceller, sorteret efter OCT4 :: EGFP positive celler, har høj udtryk i OCT4, men et andet niveau af NANOG udtryk. Vores enkelt celle genekspression analyse skal være nyttigt at afhøre befolkningsgrupper heterogeniteter.
Introduction
De fleste højere eukaryote befolkninger er heterogene således med analyse af de samlede befolkning, er det ofte vanskeligt at fortolke deres cellulære funktioner. Individuelle celler i en population kan være subtilt anderledes, og disse forskelle kan have vigtige konsekvenser for ejendommen og funktion af hele befolkningen 1, 2. Især er humane embryonale stamceller (hESCs) kendt for at være heterogen, hvilket forårsager forskellige pluripotency og forskellige potentialer til afstamning specifikation delikat særprægede måder 3, 4. For eksempel kan forskellige celleoverfladeantigener anvendes til at kategorisere udifferentierede pluripotente stamceller, 5 og Austin Smith gruppe foreslået forskellige niveauer af pluripotency i muse embryonale stamceller, baseret på deres morfologi, differentiering tilbøjelighed og afhængigheden af signalvejen 6. Dette fænomen blev hypotese i menneskelige embryonic stamceller 7. Mens de samlede undersøgelser blev udført mellem forskellige stamcellelinjer, ikke individuelle enkelt stamceller, kunne det være meget spændende at analysere forskellige niveauer af pluripotency på enkelt celle niveau, som potentielt påvirker deres differentiering kapacitet mod alle somatiske cellelinier.
Cellulære og molekylære heterogenitet kan være dikteret af transskription profilering, som kaldes 'enkelt celle transkriptom' og understreger nye tilgange til kvantificering genekspressionsniveauer 8-10. Til analyse af genekspressionsniveauer i individuelle celler, har vi udviklet en simpel, men robust protokol enkelt celle kvantitativ RT-PCR. Vi bekræftede effekten af og muligheden for vores protokol ved at sammenligne hver halvdel af enkelt cellelysater samt seriefortyndede totale RNA'er af hESCs, hvilket resulterer i minimal tekniske variationer og forskelle. Desuden brugte vi en genetisk reporter linje at isolere homogen population af hESCs bruger gene targeting system. Donoren vektor til målretning OCT4 locus (OCT4-2A-EGFP-PGK-Puro konstruere) og et par af talen plasmider blev anvendt 11. Den donorvektoren og et par Talen plasmider blev indført i hESCs (H9, WA09) ved hjælp af vores nucleofection og klonselektion protokol og vedligeholdelse af hESCs blev udført baseret på vores rutine protokol 12. Vi bekræftede denne genetiske reporter linje udtrykker EGFP for OCT4 udtryk i OCT4 :: EGFP hESCs.
Vores resultat viser, at individuelle hESCs (sorteret efter OCT4 :: EGFP stærkt positive celler) holder høje niveauer af OCT4 udtryk, men forskellige niveauer af NANOG udtryk. Så skal vores enkelt celle genekspression assay være nyttigt at studere befolkningsgrupper heterogeniteter af pluripotente stamceller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Enkelt celle gen profilering kunne være et vigtigt redskab til at forudsige funktionalitet en enkelt celle eller en hel befolkning. På grund af tekniske begrænsninger, har helt gen profilanalyse været begrænset til befolkningens gennemsnit. Variationer i genekspression mønstre og niveauer mellem de enkelte celler og subpopulationerne er blevet foreslået at forårsage fejlagtig fortolkning. Så forskellige cellulære aspekter kan findes i hESCs og deres forskelligartethed bevirker subtilt anderledes evne til at op…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke medlemmerne af Lee laboratorium til værdifulde diskussioner om manuskriptet. Arbejdet i Lee lab blev støttet af tilskud fra Robertson Investigator Award i New York Stem Cell Foundation og fra Maryland Stem Cell Research Fund (TEDCO).
Materials
| 96 wll PCR Plate | USA scientific | 1402-8900 | |
| Ambion Cell Lysis Kit | Life Technologies | 4458235 | |
| SMARTScribe Reverse Transcriptase | Clonetech | 639536 | |
| ExoSAP-IT | USB | 78200 | |
| Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304 | |
| 10mM dNTP Mix, PCR Grade | Invitrogen | 18427 | |
| SYBR Universal 2X Master Mix | Kapa biosystem | KR0389 | |
| Accutase | Innovative Cell Tech | S-1100-1 | |
| FACS buffer | 45 ml PBS, 5 ml a-MEM, 100 ul DNase, filter sterilized | ||
| 35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 |
References
- Miyanari, Y., Torres-Padilla, M. E. Control of ground-state pluripotency by allelic regulation of Nanog. Nature. 483, 470-473 (2012).
- Leitch, H. G., et al. Embryonic germ cells from mice and rats exhibit properties consistent with a generic pluripotent ground state. Development. 137, 2279-2287 (2010).
- Ramskold, D., et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nat Biotechnol. 30, 777-782 (2012).
- Stewart, M. H., et al. Clonal isolation of hESCs reveals heterogeneity within the pluripotent stem cell compartment. Nat Methods. 3, 807-815 (2006).
- O’Malley, J., et al. High-resolution analysis with novel cell-surface markers identifies routes to iPS cells. Nature. 499, 88-91 (2013).
- Nichols, J., Smith, A. Naive and primed pluripotent states. Cell Stem Cell. 4, 487-492 (2009).
- Kim, H., et al. miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 8, 695-706 (2011).
- Mortazavi, A., Williams, B. A., Mccue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat Methods. 5, 621-628 (2008).
- Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nat Genet. 40, 1413-1415 (2008).
- Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456, 470-476 (2008).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nat Biotechnol. 29, 731-734 (2011).
- Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Derivation of neural crest cells from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 5, 688-701 (2010).
- Zhu, Y. Y., Machleder, E. M., Chenchik, A., Li, R., Siebert, P. D. Reverse transcriptase template switching: A SMART (TM) approach for full-length cDNA library construction. Biotechniques. 30, 892-897 (2001).
- Pan, X. H., et al. Two methods for full-length RNA sequencing for low quantities of cells and single cells. P Natl Acad Sci USA. 110, 594-599 (2013).
- Tang, F. C., et al. RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell. Nat Protoc. 5, 516-535 (2010).
