定量的RT-PCRによって個々のヒト胚性幹細胞のプロファイリング
Summary
単一細胞の遺伝子発現アッセイは、幹細胞の不均質性を理解するために必要とされる。
Abstract
幹細胞集団の不均一性は、異なる系統に向けてその分化の傾向として、幹細胞生物学の詳細な理解を妨げる。単一細胞トランスクリプトーアッセイは、個人差を解剖するための新しいアプローチすることができます。我々は、単一細胞のqRT-PCR法を開発し、この方法は、いくつかの遺伝子発現プロファイルにうまく機能することを確認した。単一細胞レベルでは、OCT4並び順各ヒト胚性幹細胞、:: EGFP陽性細胞は、OCT4高発現であるが、NANOGの発現の異なるレベルを有する。我々の単一細胞の遺伝子発現アッセイは、不均質集団に質問するのに有用であるべきである。
Introduction
ほとんどの高等真核生物の個体数は、プールされた人口の分析をこのように不均一であり、それはそれらの細胞の機能を解釈することは困難であることが多い。集団内の個々の細胞は微妙に異なっていてもよく、これらの違いは、全人口1,2の性質及び機能に重要な影響を有することができる。特に、ヒト胚性幹細胞（hESC）は微妙に独特のやり方3、4系統の仕様に多能性と多様な電位の異なるレベルを引き起こす、不均一であることが知られている。例えば、異なる細胞表面抗原は、未分化の多能性幹細胞を分類するために使用することができ、5オースティンスミス基は、それらの形態、分化傾向と経路6シグナルの依存性をもとにして、マウス胚性幹細胞における多能性の異なるレベルを提案した。この現象は、ヒト胚に仮定されたnicの幹細胞を7。全体的な研究は、異なる幹細胞株ではなく、個々の単一の幹細胞の中で行われたのに対し、それは潜在的に全ての体細胞系統に向かって分化能力に影響を与える単一細胞レベルで多能性の異なるレベルを分析することは非常に興味深いかもしれない。
細胞および分子不均一性は、 '単一細胞トランスクリプトーム」と呼ばれる、転写プロファイリングによって決定し、遺伝子発現レベルを8月10日を定量化するための新しいアプローチを強調している可能性があります。個々の細胞における遺伝子発現レベルの分析のために、我々は、単一細胞の定量的RT-PCRの、単純で堅牢なプロトコルを開発した。我々は最小限の技術的変動および相違点で、その結果、各単一細胞溶解物の半分だけでなく、ヒトES細胞の段階希釈した全RNAを比較することによって、我々のプロトコルの有効性と実現可能性を確認した。さらに、我々は均質なPを分離するために遺伝的レポーターラインを使用ジーンターゲッティングシステムを使用してhESCのopulation。 OCT4遺伝子座（OCT4-2A-EGFP-PGK-ピューロ構築物）およびTALENプラスミドの対を標的化するためのドナーベクター11を使用した。ドナーベクターとTALENプラスミドのペアは、私たちのクレオを使用してヒトES細胞（H9、WA09）に導入し、ヒトES細胞のクローン選択プロトコルおよびメンテナンスは私たちの日常的プロトコル12に基づいて実施された。我々は、この遺伝的レポーターラインは、OCT4にOCT4発現のために、EGFPを表現:: EGFPのhESCを確認した。
私たちの結果は（OCT4によって並べ替え:: EGFP強陽性細胞）は、個々のヒトES細胞は、OCT-4の発現レベルが高いが、Nanog発現の異なるレベルを保持することを実証している。したがって、我々の単一細胞の遺伝子発現アッセイは、多能性幹細胞の集団の不均一性を研究するのに有用であるべきである。
Protocol
Representative Results
Discussion
単一細胞遺伝子プロファイリングは、単一のセルまたは集団全体の機能性を予測するための主要なツールである可能性があります。技術的な制限により、全遺伝子プロファイリング解析は、人口の平均値に制限されています。個々の細胞亜集団との間の遺伝子発現パターンおよびレベルの変動は、誤った解釈を引き起こすことが提案されている。このような多様な細胞の側面はヒトES細胞で?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、原稿上で貴重な議論のためにイ·ラボのメンバーに感謝したいと思います。李研究室での作業は、細胞研究基金（TEDCO）を幹ニューヨーク幹細胞財団のロバートソン研究者賞からメリーランド州からの補助金によって支えられている。
Materials
| 96 wll PCR Plate | USA scientific | 1402-8900 | |
| Ambion Cell Lysis Kit | Life Technologies | 4458235 | |
| SMARTScribe Reverse Transcriptase | Clonetech | 639536 | |
| ExoSAP-IT | USB | 78200 | |
| Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304 | |
| 10mM dNTP Mix, PCR Grade | Invitrogen | 18427 | |
| SYBR Universal 2X Master Mix | Kapa biosystem | KR0389 | |
| Accutase | Innovative Cell Tech | S-1100-1 | |
| FACS buffer | 45 ml PBS, 5 ml a-MEM, 100 ul DNase, filter sterilized | ||
| 35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 |
References
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