Profilering Individuell humane embryonale stamceller ved kvantitativ RT-PCR

Summary

Enkel celle genekspresjon assay er nødvendig for forståelse av stamcelle heterogeniteter.

Abstract

Heterogenitet av stamcelle befolkningen vanskelig detaljert forståelse av stamcellebiologi, slik som deres differensiering tilbøyelighet mot forskjellige linjene. En enkelt celle transcriptome analysen kan være en ny tilnærming for å dissekere individuell variasjon. Vi har utviklet en enkel celle QRT-PCR-metoden, og bekreftet at denne metode fungerer bra i flere genekspresjonsprofiler. I celle-nivå, har hvert menneske embryonale stamceller, sortert etter OCT4 :: EGFP positive celler, høy uttrykk i OCT4, men et annet nivå av NANOG uttrykk. Vår enkelt celle genuttrykk analysen bør være nyttig å forhøre befolknings heterogeniteter.

Introduction

De høyere eukaryote populasjoner er heterogene og dermed med analyse av sammenslåtte populasjonen, er det ofte vanskelig å tolke deres cellulære funksjoner. Individuelle celler i en populasjon, kan være litt forskjellig, og disse forskjeller kan ha viktige konsekvenser for egenskapen og funksjonen av hele populasjonen ^{1, 2.} Spesielt er humane embryonale stamceller (hESCs) kjent for å være heterogene, noe som fører til ulike nivåer av pluripotency og ulike potensialer til avstamning spesifikasjon i delikat særegne måter ^{tre, fire.} For eksempel kan forskjellige celleoverflateantigener anvendes til å kategorisere udifferensierte pluripotente stamceller, ⁵ og Austin Smith-gruppen foreslått forskjellige nivåer av pluripotency i mus embryonale stamceller, basert på deres morfologi, differensiering og tilbøyelighet til avhengighet av signalveien ^6.. Dette fenomenet ble antatt i menneskelige embryonic stamceller ^7. Mens de samlede studiene ble utført blant ulike stamcellelinjer, ikke individuelle enkelt stamceller, kan det være svært interessant å analysere ulike nivåer av pluripotency på celle-nivå, noe som potensielt påvirker deres differensiering kapasiteter mot alle somatiske celle slektslinjer.

Cellulært og molekylært heterogenitet kan bli diktert av transkripsjon profilering, som kalles 'enkelt celle transcriptome' og fremhever nye tilnærminger for å kvantifisere genuttrykk nivåer ^8-10. For analyse av genuttrykk nivåer i enkeltceller, har vi utviklet en enkel, men robust protokoll for enkelt celle kvantitativ RT-PCR. Vi bekreftet effekten og gjennomførbarheten av vår protokollen ved å sammenlikne hver halvdel av enkelt cellelysater samt seriefortynnet totale RNA av hESCs, noe som resulterer i minimale tekniske variasjoner og forskjeller. Videre brukte vi en genetisk reporter linje å isolere homogen population av hESCs bruker genet targeting system. Donor vektor for målretting OCT4 locus (OCT4-2A-EGFP-PGK-Puro konstruere) og et par Talen plasmider ble brukt ^11. Donor vektor og et par av talen plasmider ble innført i hESCs (H9, WA09) ved bruk av vår nucleofection og klonal valg protokoll og vedlikehold av hESCs ble utført basert på rutinemessig protokoll ^12.. Vi bekreftet denne genetiske reporter Line Express EGFP for OCT4 uttrykk i OCT4 :: EGFP hESCs.

Vårt resultat viser at enkelte hESCs (sortert etter OCT4 :: EGFP sterkt positive celler) holder høye nivåer av OCT4 uttrykk, men ulike nivåer av NANOG uttrykk. Så, bør vår enkelt celle genuttrykk analysen være nyttig å studere befolknings heterogeniteter av pluripotente stamceller.

Protocol

1.. Fremstilling av en 96-brønns plate Bland 1 mL av Single Cell DNase1 til 9 mL Single Cell Lysis Solution. Sett på 10 pl blandet løsning i hver brønn av 96-brønners PCR-plate. 2. Løsriving hESCs for FACS Rensing Ta OCT4 :: EGFP ES-cellelinje fra 60 mm skål med en ml Accutase i 20 min, ved 37 ° C, som ble nøytralisert med human ES media. Forbered cellepopulasjon i en ml FACS-buffer og justere cellen til 1 x 10 6 ce…

Representative Results

Effektiv og robust enkelt celle RNA forsterkning For å minimere transkripsjons variasjon blant hESCs, brukte vi OCT4 :: EGFP hESC klone for FACS rensing. Etter sortering Oct4 :: EGFP-positive celler i en 96-brønns plate, er hver celle lysert i lyseringsbuffer og konvertert poly (A) + RNA til full lengde-cDNA ved hjelp av SMA-T15 (GACATGTATCCGGATGTTTTTTTTTTTTTTTT) primer og forankring med SMA-A (ACATGTATCCGGATGTGGG ) ved å bruke SMART mal bytte teknologi. Det ove…

Discussion

Enkel celle genet profilering kan være et viktig verktøy for å forutsi funksjonaliteten til en enkelt celle eller et hele populasjonen. På grunn av tekniske begrensninger, har hele genet profilering analyse er begrenset til befolkningsgjennomsnitt. Variasjoner i genutrykksmønster og nivåer mellom de enkelte celler og subpopulasjoner har vært foreslått for å forårsake feilaktig tolkning. Så ulike cellulære aspekter kan bli funnet i hESCs og deres heterogenitet fører til litt forskjellig evne til å opprettho…

Materials

96 wll PCR Plate	USA scientific	1402-8900
Ambion Cell Lysis Kit	Life Technologies	4458235
SMARTScribe Reverse Transcriptase	Clonetech	639536
ExoSAP-IT	USB	78200
Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity	Invitrogen	11304
10mM dNTP Mix, PCR Grade	Invitrogen	18427
SYBR Universal 2X Master Mix	Kapa biosystem	KR0389
Accutase	Innovative Cell Tech	S-1100-1
FACS buffer			45 ml PBS, 5 ml a-MEM, 100 ul DNase, filter sterilized
35 μm cell strainer cap tubes	BD Biosciences	352235