Profilage individuel embryonnaires humaines Cellules souches par RT-PCR quantitative

Résumé

Un seul dosage de l'expression du gène cellulaire est nécessaire pour la compréhension des hétérogénéités de cellules souches.

Résumé

L'hétérogénéité de la population des cellules souches entrave compréhension détaillée de la biologie des cellules souches, telles que leur propension de différenciation vers les différentes lignées. Une analyse du transcriptome d'une cellule unique peut être une nouvelle approche pour disséquer la variation individuelle. Nous avons développé la méthode qRT-PCR seule cellule, et a confirmé que cette méthode fonctionne bien dans plusieurs profils d'expression génique. En niveau de la cellule unique, chaque cellule souche embryonnaire humaine, triées par OCT4 :: cellules positives à l'EGFP, a une forte expression dans OCT4, mais un niveau d'expression de NANOG différente. Notre analyse de l'expression des gènes de la cellule unique devrait être utile pour interroger des hétérogénéités de la population.

Introduction

Populations eucaryotes plus élevés sont hétérogènes donc à l'analyse de la population mis en commun, il est souvent difficile d'interpréter leurs fonctions cellulaires. Les cellules individuelles au sein d'une population peut être légèrement différente, et ces différences peuvent avoir des conséquences importantes pour la propriété et la fonction de l'ensemble de la population ^{1, 2.} Surtout, les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) sont connus pour être hétérogène, ce qui entraîne différents niveaux de la pluripotence et potentiels divers aux spécifications de la lignée dans délicatement façons distinctes ^{3, 4.} Par exem....

Protocole

1. Préparation d'une plaque de 96 puits

1. Mélanger 1 pl de Single Cell DNase1 à 9 pi Single Cell Lysis Solution.
2. Mettez le 10 ul solution mixte dans chaque puits de plaque de 96 puits PCR.

2. Retrait CSEh pour FACS Purification

1. Détachez OCT4 :: lignée cellulaire EGFP ES à partir de la boîte de 60 mm avec 1 ml Accutase pendant 20 min, à 37 ° C, qui ont été neutralisés avec les médias ES humaine.
2. Préparer population de cellules dans 1 ml de tampon FACS et ajuster la cellule à 1 x 10 ⁶ cellules / ml.
3. Passez l'échantillon de cellules à travers un tami....

Résultats

Efficace et robuste simple amplification de l'ARN cellulaire

Pour minimiser la variation de la transcription chez les CSEh, nous avons utilisé OCT4 :: EGFP CSEh clone pour la purification FACS. Après le tri oct4 :: cellules positives à l'EGFP dans une plaque de 96 puits, chaque cellule est lysée dans un tampon de lyse et converti poly (A) + ARN à ADNc pleine longueur à l'aide SMA-T15 (GACATGTATCCGGATGTTTTTTTTTTTTTTTT) amorce et d'ancrage av.......

Discussion

Seul gène cellulaire profilage pourrait être un outil important pour prédire la fonctionnalité d'une seule cellule ou une population entière. En raison de limitations techniques, toute l'analyse de profilage génétique a été limitée aux moyennes de la population. Variations dans les modes et les niveaux entre les cellules individuelles et les sous-populations expression génique ont été proposés pour entraîner une interprétation erronée. Ces aspects cellulaires diverses peuvent être trouvés dans les CSEh et leur h.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Plaque PCR 96 puits	USA scientific	1402-8900
Ambion Cell Lysis Kit	Life Technologies	4458235
SMARTScribe Transcriptase inverse	Clonetech	639536
ExoSAP-IT	USB	78200
Platinum Taq DNA polymérase Haute fidélité	Invitrogen	11304
10 mM dNTP Mix, PCR Grade	Invitrogen	18427
SYBR Universal 2X Master Mix	Kapa biosystem	KR0389
Accutase	Innovative Cell Tech	S-1100-1
FACS buffer			45 ml PBS, 5 ml a-MEM, 100 &mu ; l DNase, filtre stérilisé
35 &mu ; Tubes de capuchon de crépine de cellule m	BD Biosciences	352235