Kvantitative Proteomics anvendelse af reduktiv Dimethylation for mærkning med stabile isotoper
Summary
Stabil isotop mærkning af peptider ved reduktiv dimethylation (redi mærkning) er en hurtig, billig strategi for nøjagtige massespektrometri-baserede kvantitative proteomics. Her demonstrerer vi en robust metode til forberedelse og analyse af proteinblandinger hjælp Redi tilgang, der kan anvendes til næsten enhver prøvetype.
Abstract
Stabil isotop mærkning af peptider ved reduktiv dimethylation (redi mærkning) er en metode til præcist at kvantificere protein udtryk forskelle mellem prøver ved anvendelse af massespektrometri. Redi mærkningen udføres ved hjælp af enten regelmæssige (lys) eller deutereret (tunge) former af formaldehyd og natriumcyanoborhydrid at tilføje to methylgrupper til hver fri amin. Her demonstrerer vi en robust protokol for redi mærkning og kvantitativ sammenligning af komplekse proteinblandinger. Protein prøver til sammenligning er fordøjet i peptider, mærket til at bære enten lette eller tunge methyl tags, blandet, og co-analyseret ved LC-MS/MS. Relative protein mængderne kvantificeres ved at sammenligne ionkromatogram Toparealerne for tunge og lette mærkede versioner af det konstituerende peptid ekstraheres fra den fulde MS-spektre. Den her beskrevne metode omfatter prøveforberedelse ved omvendt fase fastfaseekstraktion, Redi mærkning på kolonne af peptider, peptid fraktionering ved basisk pH reversed-fase (BPRP) kromatografi og StageTip peptidoprensning. Vi diskuterer fordele og begrænsninger ved Redi mærkning med hensyn til andre metoder for stabil isotop inkorporering. Vi fremhæver nye applikationer ved hjælp redi mærkning som en hurtig, billig og præcis metode til at sammenligne protein overflod i næsten enhver form for prøve.
Introduction
Måling koncentrationsforskelle af mange proteiner mellem komplekse prøver er en central udfordring i proteomics. Stigende grad, dette bliver gjort af mærkning af proteiner i hver prøve med forskellige isotopiske tags, der kombinerer prøverne, og ved hjælp af massespektrometri til at kvantificere koncentrationsforskelle. Der findes flere metoder til stabil isotop-mærkning af proteiner og peptider. 15 N mærkning 1 og SILAC 2 indfører isotopiske etiketter metabolisk in vivo, mens ICAT 3, iTRAQ 4 og reduktion dimethylation 5 tilføje stabile isotop tags efter proteinekstraktion og fordøjelse. Blandt disse metoder er reduktiv dimethylation (redi mærkning) stigende popularitet som en billig og reproducerbar metode til at kvantificere proteinkoncentration forskelle i næsten enhver form for prøve.
Redi mærkning involverer reagerende peptider med formaldehyd til dannelse af en Schiff-base, som derefter reduceresved cyanoborhydrid. Denne reaktion dimethylates frie aminogrupper på N-Termini og lysinsidekæder og monomethylates N-terminale proliner. Protokollen beskrevet her methylerer peptider i prøve 1 med en "let" label anvendelse af reagenser med hydrogenatomer i deres naturlige isotopiske distribution og prøve 2 med en "tung" etiket ved hjælp deutereret formaldehyd og natriumcyanborhydrid (figur 1). Hver dimethylerede aminogruppe på et peptid resulterer i en massiv forskel på 6,0377 Da mellem lette og tunge former, der anvendes til at skelne mellem de to former ved hjælp af et massespektrometer. Specifikt relative peptid hyppighed kvantificeret som forholdet MS1 ekstraherede ionkromatogram områder (MS1 toparealforhold) af lette og tunge version for hvert peptid ionpar. Den relative forekomst af et protein er beregnet som den mediane MS1 toparealforhold blandt alle peptider i proteinet. I denne rapport beskriver vi en robust protokol for adfærdning Redi mærkning eksperimenter ved LC-MS/MS, der omfatter omvendt-fase peptid fast fase-ekstraktion, Redi mærkning af kolonnen, peptid fraktionering ved basisk pH-omvendt fase (BPRP) kromatografi og oprensning af peptidblandinger hjælp StageTips (figur 2) . Vi diskuterer fordele og begrænsninger ved brug af Redi mærkning for kvantitative proteomics.
Protocol
Representative Results
Discussion
Flere punkter gør stabil isotop mærkning af peptider ved hjælp af reduktiv dimethylation (redi mærkning) en attraktiv metode til kvantitative proteomics: billige mærkningsreagenser (reagenser koste mindre end $ 1 pr prøve), hurtig reaktionshastighed (~ 10 min), fravær af sideprodukter, høje reproducerbarhed (figur 3, 4), stabile reaktionsprodukter, evne til at bruge enhver protease og høj ionisering effektivitet af mærkede peptider. Kemisk mærkning af Redi er også fordelagtig i forhold til m…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank SP Gygi and GM Church for help and guidance. This work was supported by a CNRS chaire d’excellence to ACT.
Materials
| trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T9159 | protein precipitation |
| acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | protein precipitation |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | 71736 | denature, reduce protein |
| sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | denature, reduce protein |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43816 | denature, reduce, alkylate protein |
| protease Inhibitor Complete Mini Cocktail | Roche | 4693124001 | denature, reduce protein |
| iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I6125 | alkylate protein |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | resuspend, extract, label protein |
| calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | resuspend protein |
| Lysyl Endoprotease | Wako Chemicals | 129-02541 | protein digestion |
| sequencing grade trypsin | Promega | V5111 | protein digestion |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | protein digestion |
| trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 299537 | Reversed-phase peptide extraction |
| tC18 Sep-Pak C18 cartridges | Waters | WAT054960 | Reversed-phase peptide extraction |
| extraction manifold | Waters | WAT200609 | Reversed-phase peptide extraction |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 14261 | various |
| formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | “light” peptide labeling |
| cyanoborohydride | Sigma-Aldrich | 71435 | “light” peptide labeling |
| deuterated formaldehyde | Sigma-Aldrich | 492620 | “heavy” peptide labeling |
| sodium cyanoborodeuteride | CDN isotopes | D-1797 | “heavy” peptide labeling |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | peptide labeling |
| C18-HPLC column (4.6 x 250 mm, 5 µm particle size) | Agilent | 770450-902 | basic pH reversed-phase chromatography |
| formic acid | Sigma-Aldrich | 399388 | various |
| C18 Empore Disks | 3M | 14-386-3 | STAGE tips |
| methanol | Sigma-Aldrich | 494437 | STAGE tips |
References
- Washburn, M. P., Ulaszek, R., Deciu, C., Schieltz, D. M., Yates III, J. R. Analysis of quantitative proteomic data generated via multidimensional protein identification technology. Analytical chemistry. 74 (7), 1650-1657 (2002).
- Ong, S. -. E., Blagoev, B., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Molecular & cellular proteomics: MCP. 1 (5), 376-386 (2002).
- Gygi, S. P., Rist, B., Gerber, S. A., Turecek, F., Gelb, M. H., Aebersold, R. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nature biotechnology. 17 (10), 994-999 (1999).
- Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Molecular & cellular proteomics: MCP. 3 (12), 1154-1169 (2004).
- Hsu, J. -. L., Huang, S. -. Y., Chow, N. -. H., Chen, S. -. H. Stable-isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Analytical Chemistry. 75 (24), 6843-6852 (2003).
- Chick, J. M., Haynes, P. A., Molloy, M. P., Bjellqvist, B., Baker, M. S., Len, A. C. L. Characterization of the rat liver membrane proteome using peptide immobilized pH gradient isoelectric focusing. Journal of Proteome Research. 7 (3), 1036-1045 (2008).
- Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics. Analytical chemistry. 75 (3), 663-670 (2003).
- Eng, J. K., McCormack, A. L., Yates III, J. R. An approach to correlate tandem mass spectral data of peptides with amino acid sequences in a protein database. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 5 (11), 976-989 (1994).
- Elias, J. E., Gygi, S. P. Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry. Nature methods. 4 (3), 207-214 (2007).
- Bakalarski, C. E., et al. The impact of peptide abundance and dynamic range on stable-isotope-based quantitative proteomic analyses. Journal of Proteome Research. 7 (11), 4756-4765 (2008).
- Wilson-Grady, J. T., Haas, W., Gygi, S. P. Quantitative comparison of the fasted and re-fed mouse liver phosphoproteomes using lower pH reductive dimethylation. Methods (San Diego, Calif.). , (2013).
- Tolonen, A. C., Haas, W., Chilaka, A. C., Aach, J., Gygi, S. P., Church, G. M. Proteome-wide systems analysis of a cellulosic biofuel-producing microbe. Molecular Systems Biology. 7, 461 (2011).
- Tolonen, A. C., Chilaka, A. C., Church, G. M. Targeted gene inactivation in Clostridium phytofermentans shows that cellulose degradation requires the family 9 hydrolase Cphy3367. Molecular Microbiology. 74 (6), 1300-1313 (2009).
- Munoz, J., et al. The quantitative proteomes of human-induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Molecular systems biology. 7, 550 (2011).
- Kovanich, D., Cappadona, S., Raijmakers, R., Mohammed, S., Scholten, A., Heck, A. J. R. Applications of stable isotope dimethyl labeling in quantitative proteomics. Analytical and bioanalytical chemistry. 404 (4), 991-1009 (2012).
- McAlister, G. C., et al. Increasing the multiplexing capacity of TMTs using reporter ion isotopologues with isobaric masses. Analytical chemistry. 84 (17), 7469-7478 (2012).
- Boersema, P. J., Aye, T. T., Van Veen, T. A. B., Heck, A. J. R., Mohammed, S. Triplex protein quantification based on stable isotope labeling by peptide dimethylation applied to cell and tissue lysates. Proteomics. 8 (22), 4624-4632 (2008).
- Wu, Y., et al. Five-plex isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Chemical communications (Cambridge, England). , (2014).
- Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. R. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).
- She, Y. -. M., Rosu-Myles, M., Walrond, L., Cyr, T. D. Quantification of protein isoforms in mesenchymal stem cells by reductive dimethylation of lysines in intact proteins. Proteomics. 12 (3), 369-379 (2012).
- Chen, S. -. H., Chen, C. -. R., Chen, S. -. H., Li, D. -. T., Hsu, J. -. L. Improved N(α)-acetylated Peptide Enrichment Following Dimethyl Labeling and SCX. Journal of proteome research. 12 (7), 3277-3287 (2013).
- Sun, Z., et al. Capture and Dimethyl Labeling of Glycopeptides on Hydrazide Beads for Quantitative Glycoproteomics Analysis. Analytical Chemistry. 84 (20), 8452-8456 (2012).
