Kvantitative Proteomikk Bruke Reduktiv Dimethylation for stabile isotoper Merking
Summary
Stabile isotoper merking av peptider ved reduktiv dimethylation (Redi merking) er en rask, billig strategi for nøyaktige massespektrometri-basert kvantitative proteomikk. Her vi viser en robust fremgangsmåte for fremstilling og analyse av proteinblandinger ved hjelp av REDI tilnærming som kan brukes på nesten hvilken som helst prøvetype.
Abstract
Stabile isotoper merking av peptider ved reduktiv dimethylation (Redi merking) er en metode for å nøyaktig kvantifisere protein expression forskjeller mellom prøver ved hjelp av massespektrometri. Redi merkingen utføres ved hjelp av enten vanlig (lett) eller deuterert (tung) former av formaldehyd og natrium-cyanoborhydrid for å legge til to metylgrupper på hver frie amin. Her viser vi en robust protokoll for Redi merking og kvantitativ sammenligning av komplekse proteinblandinger. Protein prøver for sammenligning er fordøyd i peptider, merket å bære enten lys eller tunge metyl-koder, blandet, og co-analysert ved LC-MS/MS. Relative protein Forekomsten blir kvantifisert ved å sammenligne ion kromatogram topparealene for tunge og lette merkede versjoner av de bærende peptidet ekstrahert fra den fullstendige MS-spektra. Fremgangsmåten beskrevet her omfatter prøvepreparering ved reversfase fastfase-ekstraksjon, på en kolonne REDI merking av peptider, peptid fraksjonering ved basisk pH omdrersed-fase (BPRP) kromatografi og StageTip peptid rensing. Vi diskuterer fordeler og begrensninger av Redi merking med hensyn til andre metoder for stabile isotoper innlemmelse. Vi trekker frem nye applikasjoner ved hjelp av Redi merking som en rask, billig, og nøyaktig metode for å sammenligne protein i hopetall i nesten hvilken som helst type prøve.
Introduction
Måling konsentrasjonsforskjeller av mange proteiner mellom komplekse prøver er en sentral utfordring i proteomikk. I økende grad dette blir gjort ved merking av proteiner i hver prøve med forskjellige isotoper koder, som kombinerer prøvene, og ved hjelp av massespektrometri til kvantifisere konsentrasjonsforskjeller. Det finnes flere metoder for stabil isotoper merking av proteiner og peptider. 15 N merking ett og SILAC 2 introdusere isotopmarkører metabolsk in vivo, mens ICAT 3, iTRAQ 4, og reduksjon dimethylation fem legge stabile isotopen koder etter protein utvinning og fordøyelse. Blant disse fremgangsmåter, er reduktiv dimethylation (REDI merking) økende popularitet som en billig, reproduserbar metode for å kvantifisere protein konsentrasjonsforskjeller i nesten hvilken som helst type prøve.
Redi merking involverer reagering peptider med formaldehyd for å danne en Schiff-base, som deretter reduseresetter cyanoborhydrid. Denne reaksjonen dimethylates frie amino-grupper på N-termini og lysin sidekjeder og monomethylates N-terminale prolinene. Protokollen er beskrevet her methylates peptider i prøven 1 med en «lett» etiketten med reagenser med hydrogenatomer i deres naturlige isotoper fordeling og prøven 2 med en "tung" label med deuterert formaldehyd og natriumcyanoborhydrid (figur 1). Hver dimethylated aminogruppe på et peptid resulterer i en masseforskjell på 6,0377 Da mellom lette og tunge former, som er anvendt for å skille mellom de to former ved hjelp av et massespektrometer. Nærmere bestemt, er relative peptid Forekomsten kvantifisert som forholdstallet for MS1 ekstrahert ion kromatogram områder (MS1 toppareal-forhold) av lette og tunge versjon for hvert peptid ionepar. Den relative mengde av et protein som er beregnet som median MS1 toppareal-forhold blant alle peptider i proteinet. I denne rapporten beskriver vi en robust protokoll for oppførseling Redi merkingseksperimenter ved LC-MS/MS som omfatter reversert-fase-peptid-faststoff-fase-ekstraksjon, på en kolonne REDI merking, peptid fraksjonering ved basisk pH reversert fase (BPRP) kromatografi og rensing av peptid-blandinger ved hjelp av StageTips (Figur 2) . Vi diskuterer fordeler og begrensninger ved bruk av Redi merking for kvantitative proteomikk.
Protocol
Representative Results
Discussion
Flere punkter gjør stabile isotoper merking av peptider ved hjelp av reduktiv dimethylation (Redi merking) en attraktiv metode for kvantitative proteomikk: billig merking reagenser (reagenser koster mindre enn $ 1 per prøve), rask reaksjonshastighet (~ 10 min), fravær av sideprodukter, høye reproduserbarhet (figur 3, 4), stabile reaksjonsprodukter, evne til å bruke noen protease, og høy ionisering effektivitet av merkede peptider. Kjemisk merking av Redi er også fordelaktig i forhold til metabols…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank SP Gygi and GM Church for help and guidance. This work was supported by a CNRS chaire d’excellence to ACT.
Materials
| trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T9159 | protein precipitation |
| acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | protein precipitation |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | 71736 | denature, reduce protein |
| sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | denature, reduce protein |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43816 | denature, reduce, alkylate protein |
| protease Inhibitor Complete Mini Cocktail | Roche | 4693124001 | denature, reduce protein |
| iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I6125 | alkylate protein |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | resuspend, extract, label protein |
| calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | resuspend protein |
| Lysyl Endoprotease | Wako Chemicals | 129-02541 | protein digestion |
| sequencing grade trypsin | Promega | V5111 | protein digestion |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | protein digestion |
| trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 299537 | Reversed-phase peptide extraction |
| tC18 Sep-Pak C18 cartridges | Waters | WAT054960 | Reversed-phase peptide extraction |
| extraction manifold | Waters | WAT200609 | Reversed-phase peptide extraction |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 14261 | various |
| formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | “light” peptide labeling |
| cyanoborohydride | Sigma-Aldrich | 71435 | “light” peptide labeling |
| deuterated formaldehyde | Sigma-Aldrich | 492620 | “heavy” peptide labeling |
| sodium cyanoborodeuteride | CDN isotopes | D-1797 | “heavy” peptide labeling |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | peptide labeling |
| C18-HPLC column (4.6 x 250 mm, 5 µm particle size) | Agilent | 770450-902 | basic pH reversed-phase chromatography |
| formic acid | Sigma-Aldrich | 399388 | various |
| C18 Empore Disks | 3M | 14-386-3 | STAGE tips |
| methanol | Sigma-Aldrich | 494437 | STAGE tips |
References
- Washburn, M. P., Ulaszek, R., Deciu, C., Schieltz, D. M., Yates III, J. R. Analysis of quantitative proteomic data generated via multidimensional protein identification technology. Analytical chemistry. 74 (7), 1650-1657 (2002).
- Ong, S. -. E., Blagoev, B., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Molecular & cellular proteomics: MCP. 1 (5), 376-386 (2002).
- Gygi, S. P., Rist, B., Gerber, S. A., Turecek, F., Gelb, M. H., Aebersold, R. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nature biotechnology. 17 (10), 994-999 (1999).
- Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Molecular & cellular proteomics: MCP. 3 (12), 1154-1169 (2004).
- Hsu, J. -. L., Huang, S. -. Y., Chow, N. -. H., Chen, S. -. H. Stable-isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Analytical Chemistry. 75 (24), 6843-6852 (2003).
- Chick, J. M., Haynes, P. A., Molloy, M. P., Bjellqvist, B., Baker, M. S., Len, A. C. L. Characterization of the rat liver membrane proteome using peptide immobilized pH gradient isoelectric focusing. Journal of Proteome Research. 7 (3), 1036-1045 (2008).
- Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics. Analytical chemistry. 75 (3), 663-670 (2003).
- Eng, J. K., McCormack, A. L., Yates III, J. R. An approach to correlate tandem mass spectral data of peptides with amino acid sequences in a protein database. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 5 (11), 976-989 (1994).
- Elias, J. E., Gygi, S. P. Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry. Nature methods. 4 (3), 207-214 (2007).
- Bakalarski, C. E., et al. The impact of peptide abundance and dynamic range on stable-isotope-based quantitative proteomic analyses. Journal of Proteome Research. 7 (11), 4756-4765 (2008).
- Wilson-Grady, J. T., Haas, W., Gygi, S. P. Quantitative comparison of the fasted and re-fed mouse liver phosphoproteomes using lower pH reductive dimethylation. Methods (San Diego, Calif.). , (2013).
- Tolonen, A. C., Haas, W., Chilaka, A. C., Aach, J., Gygi, S. P., Church, G. M. Proteome-wide systems analysis of a cellulosic biofuel-producing microbe. Molecular Systems Biology. 7, 461 (2011).
- Tolonen, A. C., Chilaka, A. C., Church, G. M. Targeted gene inactivation in Clostridium phytofermentans shows that cellulose degradation requires the family 9 hydrolase Cphy3367. Molecular Microbiology. 74 (6), 1300-1313 (2009).
- Munoz, J., et al. The quantitative proteomes of human-induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Molecular systems biology. 7, 550 (2011).
- Kovanich, D., Cappadona, S., Raijmakers, R., Mohammed, S., Scholten, A., Heck, A. J. R. Applications of stable isotope dimethyl labeling in quantitative proteomics. Analytical and bioanalytical chemistry. 404 (4), 991-1009 (2012).
- McAlister, G. C., et al. Increasing the multiplexing capacity of TMTs using reporter ion isotopologues with isobaric masses. Analytical chemistry. 84 (17), 7469-7478 (2012).
- Boersema, P. J., Aye, T. T., Van Veen, T. A. B., Heck, A. J. R., Mohammed, S. Triplex protein quantification based on stable isotope labeling by peptide dimethylation applied to cell and tissue lysates. Proteomics. 8 (22), 4624-4632 (2008).
- Wu, Y., et al. Five-plex isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Chemical communications (Cambridge, England). , (2014).
- Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. R. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).
- She, Y. -. M., Rosu-Myles, M., Walrond, L., Cyr, T. D. Quantification of protein isoforms in mesenchymal stem cells by reductive dimethylation of lysines in intact proteins. Proteomics. 12 (3), 369-379 (2012).
- Chen, S. -. H., Chen, C. -. R., Chen, S. -. H., Li, D. -. T., Hsu, J. -. L. Improved N(α)-acetylated Peptide Enrichment Following Dimethyl Labeling and SCX. Journal of proteome research. 12 (7), 3277-3287 (2013).
- Sun, Z., et al. Capture and Dimethyl Labeling of Glycopeptides on Hydrazide Beads for Quantitative Glycoproteomics Analysis. Analytical Chemistry. 84 (20), 8452-8456 (2012).
