Kwantitatieve Proteomics behulp Reductieve dimethylering voor stabiele isotopen Labeling
Summary
Stabiele isotoop labeling van peptiden door reductieve dimethylering (Redi etikettering) is een snelle, goedkope strategie voor nauwkeurige massa-spectrometrie gebaseerde kwantitatieve proteomics. Hier laten we een robuuste werkwijze voor de bereiding en analyse van eiwitmengsels met de Redi aanpak die kan worden toegepast op vrijwel elk type monster.
Abstract
Stabiele isotopen van peptiden door reductieve dimethylering (Redi labeling) is een methode om nauwkeurig kwantificeren eiwitexpressie verschillen tussen monsters met behulp van massaspectrometrie. Redi etikettering wordt uitgevoerd met behulp van gewone (licht) of gedeutereerde (zware) vormen van formaldehyde en natriumcyaanboriumhydride twee methylgroepen toevoegen aan elke vrije amine. Hier laten we zien een robuust protocol voor Redi etikettering en kwantitatieve vergelijking van complexe eiwitmengsels. Eiwitmonsters ter vergelijking worden gedigesteerd in peptiden gelabeld ofwel lichte of zware methyl markeringen, gemengd en samen geanalyseerd met LC-MS/MS dragen. Relatieve dichtheden eiwit gekwantificeerd door vergelijking van de ionenchromatogram piekoppervlakten van zware en lichte gemerkte versies van de samenstellende peptide geëxtraheerd uit de volledige MS-spectra. De hier beschreven methode is inclusief monstervoorbereiding met reversed phase vaste-fase-extractie, on-column Redi etikettering van peptiden, peptide fractionering door basische pH reversed-fase (BPRP) chromatografie, en StageTip peptide zuivering. We bespreken de voordelen en beperkingen van Redi etikettering met betrekking tot andere methoden voor een stabiele isotoop oprichting. We belichten nieuwe toepassingen met Redi labeling als een snelle, goedkope en nauwkeurige methode om eiwit abondantie vergelijken in bijna elk soort monster.
Introduction
Het meten van de concentratie verschillen van veel eiwitten tussen complexe monsters is een centrale uitdaging in proteomics. In toenemende mate wordt dit gedaan door het merken van eiwitten in elk monster met verschillende isotopische labels combineren van de monsters en met massaspectrometrie om concentratieverschillen kwantificeren. Verschillende methoden bestaan voor stabiele isotopische labeling van eiwitten en peptiden. 15 N etikettering 1 en 2 SILAC voeren isotopische labels metabolisch in vivo, terwijl iCAT 3, iTRAQ 4 en vermindering dimethylering 5 commentaar stabiele isotoop labels na eiwitextractie en vertering. Onder deze methoden, is reductieve dimethylering (Redi etikettering) aan populariteit wint als een goedkope en reproduceerbare methode om eiwitconcentratie verschillen in bijna elk type monster te kwantificeren.
Redi etikettering omvat peptiden reageren met formaldehyde om een Schiff base, dat vervolgens wordt gereduceerd vormendoor cyanoboorhydride. Deze reactie dimethylates vrije aminogroepen op N-uiteinden en lysinezijketens en monomethylates N-terminale prolines. De hier beschreven protocol methyleert peptiden in monster 1 met een "lichte" label met reagentia met waterstofatomen in hun natuurlijke isotopische distributie en monster 2 met een "zware" label met gedeutereerd formaldehyde en dride (figuur 1). Elke digemethyleerd aminogroep op een peptide resulteert in een massaverschil van 6,0377 Da tussen lichte en zware vormen, die wordt gebruikt om onderscheid te maken tussen de twee vormen met een massaspectrometer. In het bijzonder, zijn ten opzichte van peptide abundanties gekwantificeerd als de verhouding van MS1 gewonnen ionenchromatogram gebieden (MS1 piekoppervlakte ratio) van lichte en zware uitvoering voor elk peptide ionenpaar. De relatieve abundantie van een eiwit wordt berekend als de mediaan MS1 piekoppervlak verhouding tussen alle peptiden in het proteïne. In dit rapport beschrijven we een robuust protocol voor gedraging Redi markeringsexperimenten door LC-MS/MS dat omgekeerde fase peptide vaste fase extractie op-kolom Redi etikettering peptide fractionering door basische pH omgekeerde fase (BPRP) chromatografie en zuivering van peptide mengsels met StageTips (figuur 2) omvat . We bespreken de voordelen en beperkingen van het gebruik van Redi etikettering voor kwantitatieve proteomics.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een aantal punten maken stabiele isotoop labeling van peptiden met behulp van reductieve dimethylering (Redi etikettering) een aantrekkelijke methode voor kwantitatieve proteomics: goedkoop etikettering reagens (reagentia kost minder dan $ 1 per monster), snelle reactiesnelheid (~ 10 min), de afwezigheid van nevenproducten, hoge reproduceerbaarheid (figuren 3, 4), stabiele reactieproducten, mogelijkheid om een protease te gebruiken en hoge ionisatie-efficiëntie van gelabelde peptiden. Chemische labelin…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank SP Gygi and GM Church for help and guidance. This work was supported by a CNRS chaire d’excellence to ACT.
Materials
| trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T9159 | protein precipitation |
| acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | protein precipitation |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | 71736 | denature, reduce protein |
| sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | denature, reduce protein |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43816 | denature, reduce, alkylate protein |
| protease Inhibitor Complete Mini Cocktail | Roche | 4693124001 | denature, reduce protein |
| iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I6125 | alkylate protein |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | resuspend, extract, label protein |
| calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | resuspend protein |
| Lysyl Endoprotease | Wako Chemicals | 129-02541 | protein digestion |
| sequencing grade trypsin | Promega | V5111 | protein digestion |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | protein digestion |
| trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 299537 | Reversed-phase peptide extraction |
| tC18 Sep-Pak C18 cartridges | Waters | WAT054960 | Reversed-phase peptide extraction |
| extraction manifold | Waters | WAT200609 | Reversed-phase peptide extraction |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 14261 | various |
| formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | “light” peptide labeling |
| cyanoborohydride | Sigma-Aldrich | 71435 | “light” peptide labeling |
| deuterated formaldehyde | Sigma-Aldrich | 492620 | “heavy” peptide labeling |
| sodium cyanoborodeuteride | CDN isotopes | D-1797 | “heavy” peptide labeling |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | peptide labeling |
| C18-HPLC column (4.6 x 250 mm, 5 µm particle size) | Agilent | 770450-902 | basic pH reversed-phase chromatography |
| formic acid | Sigma-Aldrich | 399388 | various |
| C18 Empore Disks | 3M | 14-386-3 | STAGE tips |
| methanol | Sigma-Aldrich | 494437 | STAGE tips |
References
- Washburn, M. P., Ulaszek, R., Deciu, C., Schieltz, D. M., Yates III, J. R. Analysis of quantitative proteomic data generated via multidimensional protein identification technology. Analytical chemistry. 74 (7), 1650-1657 (2002).
- Ong, S. -. E., Blagoev, B., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Molecular & cellular proteomics: MCP. 1 (5), 376-386 (2002).
- Gygi, S. P., Rist, B., Gerber, S. A., Turecek, F., Gelb, M. H., Aebersold, R. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nature biotechnology. 17 (10), 994-999 (1999).
- Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Molecular & cellular proteomics: MCP. 3 (12), 1154-1169 (2004).
- Hsu, J. -. L., Huang, S. -. Y., Chow, N. -. H., Chen, S. -. H. Stable-isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Analytical Chemistry. 75 (24), 6843-6852 (2003).
- Chick, J. M., Haynes, P. A., Molloy, M. P., Bjellqvist, B., Baker, M. S., Len, A. C. L. Characterization of the rat liver membrane proteome using peptide immobilized pH gradient isoelectric focusing. Journal of Proteome Research. 7 (3), 1036-1045 (2008).
- Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics. Analytical chemistry. 75 (3), 663-670 (2003).
- Eng, J. K., McCormack, A. L., Yates III, J. R. An approach to correlate tandem mass spectral data of peptides with amino acid sequences in a protein database. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 5 (11), 976-989 (1994).
- Elias, J. E., Gygi, S. P. Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry. Nature methods. 4 (3), 207-214 (2007).
- Bakalarski, C. E., et al. The impact of peptide abundance and dynamic range on stable-isotope-based quantitative proteomic analyses. Journal of Proteome Research. 7 (11), 4756-4765 (2008).
- Wilson-Grady, J. T., Haas, W., Gygi, S. P. Quantitative comparison of the fasted and re-fed mouse liver phosphoproteomes using lower pH reductive dimethylation. Methods (San Diego, Calif.). , (2013).
- Tolonen, A. C., Haas, W., Chilaka, A. C., Aach, J., Gygi, S. P., Church, G. M. Proteome-wide systems analysis of a cellulosic biofuel-producing microbe. Molecular Systems Biology. 7, 461 (2011).
- Tolonen, A. C., Chilaka, A. C., Church, G. M. Targeted gene inactivation in Clostridium phytofermentans shows that cellulose degradation requires the family 9 hydrolase Cphy3367. Molecular Microbiology. 74 (6), 1300-1313 (2009).
- Munoz, J., et al. The quantitative proteomes of human-induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Molecular systems biology. 7, 550 (2011).
- Kovanich, D., Cappadona, S., Raijmakers, R., Mohammed, S., Scholten, A., Heck, A. J. R. Applications of stable isotope dimethyl labeling in quantitative proteomics. Analytical and bioanalytical chemistry. 404 (4), 991-1009 (2012).
- McAlister, G. C., et al. Increasing the multiplexing capacity of TMTs using reporter ion isotopologues with isobaric masses. Analytical chemistry. 84 (17), 7469-7478 (2012).
- Boersema, P. J., Aye, T. T., Van Veen, T. A. B., Heck, A. J. R., Mohammed, S. Triplex protein quantification based on stable isotope labeling by peptide dimethylation applied to cell and tissue lysates. Proteomics. 8 (22), 4624-4632 (2008).
- Wu, Y., et al. Five-plex isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Chemical communications (Cambridge, England). , (2014).
- Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. R. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).
- She, Y. -. M., Rosu-Myles, M., Walrond, L., Cyr, T. D. Quantification of protein isoforms in mesenchymal stem cells by reductive dimethylation of lysines in intact proteins. Proteomics. 12 (3), 369-379 (2012).
- Chen, S. -. H., Chen, C. -. R., Chen, S. -. H., Li, D. -. T., Hsu, J. -. L. Improved N(α)-acetylated Peptide Enrichment Following Dimethyl Labeling and SCX. Journal of proteome research. 12 (7), 3277-3287 (2013).
- Sun, Z., et al. Capture and Dimethyl Labeling of Glycopeptides on Hydrazide Beads for Quantitative Glycoproteomics Analysis. Analytical Chemistry. 84 (20), 8452-8456 (2012).
