La reconstitución de la degradación de β-catenina en<em> Xenopus</em> Extracto de Huevo

Summary

Se describe un método para el análisis de la degradación de proteínas usando radiomarcado y proteínas de fusión luciferasa-en extracto de huevo de Xenopus y su adaptación para la selección de alto rendimiento para moduladores de moléculas pequeñas de la degradación de proteínas.

Abstract

Extracto de huevo de Xenopus laevis es un bien caracterizado, sistema robusto para el estudio de la bioquímica de los diversos procesos celulares. Extracto de huevo de Xenopus se ha utilizado para estudiar el recambio de proteínas en muchos contextos celulares, incluyendo el ciclo celular y las vías de transducción de señales ^1-3. En la presente memoria, se describe un método para el aislamiento de extracto de huevo de Xenopus que se ha optimizado para promover la degradación del componente de la ruta de Wnt crítico, β-catenina. Dos diferentes métodos se describen para evaluar la degradación de proteína β-catenina en el extracto de huevo Xenopus. Un método es visualmente informativo ^([35 S]-radiomarcado proteínas), mientras que el otro se escala más fácilmente para ensayos de alto rendimiento (proteínas de fusión de luciferasa de luciérnaga-etiquetados). Las técnicas descritas se pueden utilizar para, pero no se limitan a, evaluar β-catenina recambio de proteínas e identificar componentes moleculares que contribuyen a su volumen de negocios. Además, el Abildad para purificar grandes volúmenes de extracto de huevo de Xenopus homogénea combinada con la lectura cuantitativa y fácil de proteínas de luciferasa de etiquetado permite que este sistema sea adaptado fácilmente para la selección de alto rendimiento para moduladores de la degradación de β-catenina.

Introduction

Extracto de huevo Xenopus laevis se ha utilizado ampliamente para estudiar muchos procesos biológicos celulares, incluyendo la dinámica del citoesqueleto, ensamblaje nuclear y la importación, la apoptosis, el metabolismo de la ubiquitina, la progresión del ciclo celular, la transducción de señales, y el recambio proteico ^1-17. El sistema de extracto de huevo de Xenopus es susceptible al análisis bioquímico de una legión de procesos celulares debido extracto de huevo representa esencialmente citoplasma sin diluir que contiene todos los componentes citoplasmáticos esenciales necesarios para ejecutar estos procesos y permitir investigación. Grandes cantidades de extracto de huevo se pueden preparar de una sola vez para manipulaciones bioquímicas que requieren grandes cantidades de material (por ejemplo, la purificación de proteínas o cribado de alto rendimiento) ^18-20. Otra ventaja es que la concentración de proteínas específicas en extracto de huevo de Xenopus puede ajustarse con precisión mediante la adición de proteína y / o inmunodepleción de EndoG recombinanteproteínas genas en contraste con la transfección de ADN de plásmido en donde es difícil de controlar la expresión de la proteína de interés. Además, la falta de proteínas recombinantes disponibles puede ser superado por la adición de las transcripciones que codifican la proteína de interés, tomando ventaja de la alta capacidad de la recién preparada de Xenopus de extracto de huevo para traducir ARNm añadidas de forma exógena.

La regulación de la degradación de proteínas es crítica para el control de muchas vías celulares y procesa ^21. Extracto de huevo de Xenopus se ha utilizado ampliamente para estudiar la degradación de proteínas como el sistema permite múltiples formas de controlar el recambio de proteínas y sin influencias de confusión de la transcripción y la traducción. La vía de señalización de Wnt es una vía de señalización altamente conservadas que desempeña papeles críticos en el desarrollo y la enfermedad. El volumen de negocio de β-catenina, el principal efector de la vía Wnt, está muy regulada, y un aumento del estado de equilibrio lEvel de β-catenina es crítica para la activación de los genes diana de Wnt. La importancia de la degradación de β-catenina se pone de relieve por el hecho de que las mutaciones en la vía Wnt que inhiben la degradación de β-catenina encuentran en ~ 90% de todos los casos esporádicos de cáncer colorrectal ^22. degradación de β-catenina por componentes de la vía Wnt puede ser recapitulado fielmente en extracto de huevo Xenopus para estudiar el mecanismo de su volumen de negocios, así como para identificar nuevos moduladores de molécula pequeña de su degradación ^{2, 19, 20, 23-29.}

Los métodos para la preparación de extracto de huevo de Xenopus para estudiar el ciclo celular se han descrito en publicaciones anteriores JoVE ^30-32. El protocolo actual describe una modificación de estos métodos y está optimizado para la degradación de ^[35 S]-radiomarcado β-catenina y luciferasa-etiquetados β-catenina enExtracto de huevo Xenopus. El ensayo de degradación radiomarcado permite la visualización directa de los niveles de proteína a través de la autorradiografía. ^[35 S] metionina se incorpora en la proteína de interés usando una reacción de traducción in vitro que luego se puede añadir directamente a una reacción de degradación. Además, el ensayo de volumen de negocios proteína radiomarcada no requiere un anticuerpo contra la proteína de interés o una etiqueta de epítopo, que puede influir en la estabilidad de proteínas. Debido a que incluso pequeños cambios en los niveles de proteína, tal como se refleja en cambios en la intensidad de la banda de proteína radiomarcada, se visualizan fácilmente por autorradiografía, el ^[35 S]-radiomarcado ensayo de degradación representa un método muy útil para la visualización de rotación de proteínas ^2.

La fusión de β-catenina a luciferasa de luciérnaga (en adelante denominado simplemente "luciferasa") permite mediciones cuantitativas precisas y fáciles de los niveles de proteína, con el finpara determinar las propiedades cinéticas de rotación de β-catenina ^{19, 20.} Una ventaja importante de el ensayo de luciferasa es que proporciona un fuerte sistema cuantitativo que se puede escalar fácilmente hasta. El siguiente protocolo proporciona métodos simples para el ensayo de degradación de β-catenina y un método robusto, eficiente y eficaz para la selección de alto rendimiento de nuevos moduladores β-catenina.

Protocol

1. Preparación de extracto de huevo de Xenopus NOTA: Cada rana produce aproximadamente 1 ml de extracto de huevo utilizable. Extractos de 10 ranas se preparan típicamente en un tiempo, y el volumen de tampón se describe a continuación es para la realización de un 10 rana Xenopus extracto de huevo de preparación. El volumen de tampón puede ser ajustada en consecuencia para las preparaciones más grandes o más pequeñas de extracto de huevo. Preps generados de esta mane…

Representative Results

Un esquema de la degradación de β-catenina en extracto de huevo de Xenopus se muestra en la Figura 2A. 35 marcado con S β-catenina se incubó en extracto de huevo de Xenopus, partes alícuotas (1 ml extraer equivalente) se eliminaron en los momentos apropiados, y las muestras se sometieron a SDS-PAGE seguida de autorradiografía. la degradación de β-catenina por componentes de la vía de Wnt está mediada por el sistema de ubiquitina-proteasoma 2, y la degrad…

Discussion

Extracto de huevo Xenopus es un sistema bioquímico sólida para la investigación de rotación β-catenina. La concentración de β-catenina en el extracto de huevo Xenopus es de ~ 25 nM ^2. En condiciones óptimas, el extracto de huevo es capaz de degradar β-catenina a una velocidad de 50-100 nM / h, y es mitad de la máxima a 200 nM ^24. Hay varios pasos críticos para la reconstitución exitosa de la degradación de β-catenina usando extracto de huevo Xenopus. Estos i…

Materials

Name of Reagent/ Material	Company	Catalog Number	Comments/Description
Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG)	ProSpec	hor-272-A	Reconstituted with distilled water before use.
Human Chorionic Gonadotropin	Sigma	CG10-10VL
Potassium Chloride	Fisher	BP366-1
Sodium Chloride	Research Products International	S23020-5000.0
Magnesium Chloride	Fisher	BP214-500
Calcium Chloride	Acros Organics	AC42352-5000
HEPES	Fisher	BP310-1
Cysteine	Acros Organics	AC17360-1000
Leupeptin	Sigma	L2884-10MG
Aprotinin	Sigma	A1153-10MG
Pepstatin	Sigma	P4265-5MG
Cytochalasin B	Sigma	C8273-10MG
3 mL syringe: Luer Lock tip	Becton Dickinson	309657
27G1 needle	Becton Dickinson	305109
96 well solid white polystyrene microplate, round bottomed	Corning	3605
Steady-Glo Luciferase assay system	Promega	E2520	Store long-term at -80, can store for up to 1 month at -20
TNT Sp6 coupled reticulocyte lysate system	Promega	L4600
TNT Sp6 High-yield Wheat Germ protein expression system	Promega	L3260	Generally higher yield than reticulocyte lysate
EasyTag Express Protein Labeling Mix [S35]	Perkin Elmer	NEG772007MC
Creatine phosphate	Sigma	27920-5G
ATP	Sigma	A2383-5G
Creatine phosphokinase	Sigma	C3755-35KU
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma	D8418-50ML
Dual-Glo luciferase assay system	Promega	E2920	Same storage conditions as Steady-Glo
50 mL Centrifuge tubes	Fisher Scientific	0556214D
Sorvall SS-34 fixed angle rotor	Thermo Scientific	28020
115 V 50/60 Hz Minicentrifuge	Fisher Scientific	05-090-128
mMessage mMachine Sp6 kit	Ambion	AM1340
Anti-Firefly Luciferase antibody	Abcam	ab16466
Anti-GSK3 antibody	BD Transduction Laboratories	610201
Name of Equipment	Company
FLUOStar Optima	BMG Labtech
Sorvall RC-6 Plus Centrifuge	Thermo Scientific
16°C Incubator	Percival Scientific