Β-catenin गिरावट में के पुनर्गठन<em> Xenopus</em> अंडा निकालें
Summary
एक विधि Xenopus अंडा निकालने और प्रोटीन गिरावट के छोटे अणु modulators के लिए उच्च throughput प्रदर्शन के लिए अपने अनुकूलन में radiolabeled और luciferase संलयन प्रोटीन का उपयोग प्रोटीन गिरावट का विश्लेषण करने के लिए वर्णित है.
Abstract
Xenopus laevis अंडे निकाल सकते हैं. Xenopus अंडा निकालने सेल चक्र और संकेत पारगमन मार्ग 1-3 सहित कई सेलुलर संदर्भों में प्रोटीन कारोबार का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है विविध सेलुलर प्रक्रियाओं के जैव रसायन के अध्ययन के लिए एक अच्छी तरह से विशेषता, मजबूत प्रणाली है. इस के साथ साथ, एक विधि महत्वपूर्ण Wnt मार्ग घटक, β-catenin की गिरावट को बढ़ावा देने के लिए अनुकूलित किया गया है कि Xenopus अंडा निकालने के लिए अलग वर्णन किया गया है. दो अलग अलग तरीकों Xenopus अंडा निकालने में β-catenin प्रोटीन गिरावट का आकलन करने के लिए वर्णित हैं. अन्य अधिक आसानी से उच्च throughput assays (जुगनू luciferase टैग फ्यूजन प्रोटीन) के लिए बढ़ाया है, जबकि एक विधि, ([35 एस]-radiolabeled प्रोटीन) नेत्रहीन जानकारीपूर्ण है. वर्णित तकनीकों β-catenin प्रोटीन कारोबार का आकलन करने और अपने कारोबार के लिए योगदान दे आणविक घटकों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन तक सीमित नहीं हैं. इसके अतिरिक्त, abilluciferase टैग प्रोटीन की मात्रात्मक और सतही readout के साथ संयुक्त समरूप Xenopus अंडा निकालने के लिए बड़ी मात्रा में शुद्ध करने के लिए अल्पसंख्यक इस प्रणाली को आसानी से β-catenin गिरावट के modulators के लिए उच्च throughput प्रदर्शन के लिए अनुकूलित किया जा करने की अनुमति देता है.
Introduction
Xenopus laevis अंडे निकालने cytoskeletal गतिशीलता, परमाणु विधानसभा और आयात, apoptosis, ubiquitin चयापचय, सेल चक्र प्रगति, संकेत पारगमन, और प्रोटीन कारोबार 1-17 सहित कई सेल जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है. अंडा निकालने अनिवार्य रूप से इन प्रक्रियाओं पर अमल और जांच सक्षम करने के लिए आवश्यक सभी आवश्यक cytoplasmic घटक शामिल है कि undiluted कोशिका द्रव्य का प्रतिनिधित्व करता है, क्योंकि Xenopus अंडा निकालने प्रणाली सेलुलर प्रक्रियाओं के एक सैन्य टुकड़ी के जैव रासायनिक विश्लेषण करने के लिए उत्तरदायी है. अंडा निकालने की बड़ी मात्रा में सामग्री (जैसे, प्रोटीन शुद्धि या उच्च throughput स्क्रीनिंग) 18-20 की बड़ी मात्रा की आवश्यकता है कि जैव रासायनिक जोड़तोड़ के लिए एक समय में तैयार किया जा सकता है. एक और लाभ यह Xenopus अंडा निकालने में विशिष्ट प्रोटीन की एकाग्रता ठीक पुनः संयोजक प्रोटीन और / या endog की immunodepletion के अलावा द्वारा समायोजित किया जा सकता हैब्याज की प्रोटीन की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने के लिए मुश्किल है, जहां प्लास्मिड डीएनए के अभिकर्मक के विपरीत enous प्रोटीन. इसके अलावा, उपलब्ध पुनः संयोजक प्रोटीन की कमी exogenously गयी mRNA अनुवाद करने के लिए हौसले से तैयार Xenopus अंडा निकालने के लिए उच्च क्षमता का लाभ लेने, ब्याज की प्रोटीन एन्कोडिंग टेप के अलावा द्वारा दूर किया जा सकता है.
प्रोटीन गिरावट के नियमन कई सेलुलर रास्ते के नियंत्रण के लिए महत्वपूर्ण है और 21. Xenopus अंडा निकालने प्रणाली प्रतिलेखन और अनुवाद के confounding प्रभाव के बिना प्रोटीन कारोबार पर नजर रखने के लिए कई तरीके के लिए अनुमति देता है के रूप में प्रोटीन गिरावट का अध्ययन करने के लिए बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है प्रक्रियाओं. WNT सिगनल मार्ग विकास और बीमारी में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है कि एक उच्च संरक्षित संकेतन मार्ग है. β-catenin, Wnt मार्ग का प्रमुख प्रेरक का कारोबार, अत्यधिक एक वृद्धि स्थिर राज्य एल विनियमित, और हैβ-catenin की Evel Wnt लक्ष्य जीन की सक्रियता के लिए महत्वपूर्ण है. β-catenin गिरावट के महत्व β-catenin गिरावट बाधित कि Wnt मार्ग में परिवर्तन के ~ कोलोरेक्टल कैंसर 22 के सभी छिटपुट मामलों के 90% में पाया कि इस तथ्य से प्रकाश डाला है. Wnt मार्ग के घटकों द्वारा β-catenin गिरावट ईमानदारी से अपने कारोबार की व्यवस्था का अध्ययन करने के साथ ही इसकी गिरावट 2, 19, 20, 23-29 के उपन्यास छोटे अणु modulators की पहचान करने के लिए Xenopus अंडा निकालने में recapitulated किया जा सकता है.
सेल चक्र के अध्ययन के लिए Xenopus अंडा निकालने की तैयारी के लिए तरीके पिछले जौव प्रकाशनों 30-32 में वर्णित किया गया है. मौजूदा प्रोटोकॉल इन तरीकों में से एक संशोधन का वर्णन करता है और की गिरावट के लिए अनुकूलित है [35 एस]-radiolabeled β-catenin और luciferase टैग β-catenin मेंXenopus अंडा निकाल सकते हैं. radiolabeled गिरावट परख autoradiography के माध्यम से प्रोटीन के स्तर के प्रत्यक्ष दृश्य के लिए अनुमति देता है. [35 एस] methionine तो सीधे एक गिरावट प्रतिक्रिया करने के लिए जोड़ा जा सकता है कि इन विट्रो अनुवाद प्रतिक्रिया का उपयोग ब्याज की प्रोटीन में शामिल किया है. इसके अलावा, radiolabeled प्रोटीन कारोबार परख प्रोटीन स्थिरता को प्रभावित कर सकते हैं, जो ब्याज की प्रोटीन या एक मिलान टैग, के खिलाफ एक एंटीबॉडी की आवश्यकता नहीं है. प्रोटीन के स्तर में भी छोटे परिवर्तन, radiolabeled प्रोटीन बैंड की तीव्रता में परिवर्तन के रूप में परिलक्षित, आसानी से autoradiography द्वारा कल्पना कर रहे हैं, [35 एस]-radiolabeled गिरावट परख प्रोटीन कारोबार 2 के दृश्य के लिए एक बहुत ही उपयोगी विधि का प्रतिनिधित्व करता है.
आदेश में जुगनू luciferase को β-catenin की फ्यूजन (इसके बाद बस के रूप में "luciferase" कहा जाता है), प्रोटीन के स्तर की सटीक और सरल मात्रात्मक मापन के लिए अनुमति देता हैβ-catenin कारोबार 19, 20 की गतिज गुणों का निर्धारण करने के लिए. Luciferase परख का एक बड़ा फायदा यह है कि यह आसानी से पहुंचा है कि एक मजबूत मात्रात्मक प्रणाली प्रदान करता है. निम्नलिखित प्रोटोकॉल β-catenin गिरावट और उपन्यास β-catenin modulators के उच्च throughput प्रदर्शन के लिए एक मजबूत, कुशल, और प्रभावी विधि परख करने की क्रिया के लिए सरल तरीके प्रदान करता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
Xenopus अंडा निकालने β-catenin कारोबार की जांच के लिए एक मजबूत जैव रासायनिक प्रणाली है. Xenopus अंडा निकालने में β-catenin की एकाग्रता ~ 25 एनएम 2 है. इष्टतम शर्तों के तहत, अंडा निकालने 50-100 एनएम / घंटा की दर से β-catenin अपमा?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए लॉरी ली धन्यवाद. TWC एक अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन predoctoral फैलोशिप (12PRE6590007) द्वारा समर्थित है. MRB एक राष्ट्रीय कैंसर संस्थान प्रशिक्षण अनुदान (T32 CA119925) द्वारा समर्थित है. SSH राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (R01DK078640) द्वारा समर्थित है. ईएल राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (R01GM081635 और R01GM103926) द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name of Reagent/ Material | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG) | ProSpec | hor-272-A | Reconstituted with distilled water before use. |
| Human Chorionic Gonadotropin | Sigma | CG10-10VL | |
| Potassium Chloride | Fisher | BP366-1 | |
| Sodium Chloride | Research Products International | S23020-5000.0 | |
| Magnesium Chloride | Fisher | BP214-500 | |
| Calcium Chloride | Acros Organics | AC42352-5000 | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Cysteine | Acros Organics | AC17360-1000 | |
| Leupeptin | Sigma | L2884-10MG | |
| Aprotinin | Sigma | A1153-10MG | |
| Pepstatin | Sigma | P4265-5MG | |
| Cytochalasin B | Sigma | C8273-10MG | |
| 3 mL syringe: Luer Lock tip | Becton Dickinson | 309657 | |
| 27G1 needle | Becton Dickinson | 305109 | |
| 96 well solid white polystyrene microplate, round bottomed | Corning | 3605 | |
| Steady-Glo Luciferase assay system | Promega | E2520 | Store long-term at -80, can store for up to 1 month at -20 |
| TNT Sp6 coupled reticulocyte lysate system | Promega | L4600 | |
| TNT Sp6 High-yield Wheat Germ protein expression system | Promega | L3260 | Generally higher yield than reticulocyte lysate |
| EasyTag Express Protein Labeling Mix [S35] | Perkin Elmer | NEG772007MC | |
| Creatine phosphate | Sigma | 27920-5G | |
| ATP | Sigma | A2383-5G | |
| Creatine phosphokinase | Sigma | C3755-35KU | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418-50ML | |
| Dual-Glo luciferase assay system | Promega | E2920 | Same storage conditions as Steady-Glo |
| 50 mL Centrifuge tubes | Fisher Scientific | 0556214D | |
| Sorvall SS-34 fixed angle rotor | Thermo Scientific | 28020 | |
| 115 V 50/60 Hz Minicentrifuge | Fisher Scientific | 05-090-128 | |
| mMessage mMachine Sp6 kit | Ambion | AM1340 | |
| Anti-Firefly Luciferase antibody | Abcam | ab16466 | |
| Anti-GSK3 antibody | BD Transduction Laboratories | 610201 | |
| Name of Equipment | Company | ||
| FLUOStar Optima | BMG Labtech | ||
| Sorvall RC-6 Plus Centrifuge | Thermo Scientific | ||
| 16°C Incubator | Percival Scientific |
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