Reconstitutie van β-catenine afbraak in<em> Xenopus</em> Egg Extract

Summary

Een werkwijze wordt beschreven voor het analyseren eiwitafbraak met radioactief gemerkt en luciferase-fusie-eiwitten in Xenopus ei extract en de aanpassing voor high-throughput screening kleinmoleculige modulatoren van eiwitafbraak.

Abstract

Xenopus laevis ei extract is een goed gekarakteriseerd, robuust systeem voor het bestuderen van de biochemie van diverse cellulaire processen. Xenopus ei extract gebruikt om eiwitturover studeren in vele cellulaire contexten, zoals de celcyclus en signaaltransductie ^1-3. Hierin wordt een werkwijze beschreven voor het isoleren Xenopus ei extract die is geoptimaliseerd om de afbraak van de kritische Wnt component, β-catenine bevorderen. Twee verschillende methoden beschreven β-catenine eiwitafbraak beoordelen Xenopus ei extract. Een methode is visueel informatief ^([35 S]-radioactief gemerkte eiwitten), terwijl de andere gemakkelijker geschaald voor high-throughput assays (vuurvlieg luciferase-gemerkte fusie-eiwitten). De beschreven technieken kunnen worden gebruikt, maar zijn niet beperkt tot, beoordelen β-catenine eiwit omzet en identificeren van moleculaire componenten die bijdragen aan de omzet. Bovendien, de Abilheid om grote hoeveelheden homogene Xenopus ei extract gecombineerd met kwantitatieve en gemakkelijke uitlezing van luciferase-gemerkte eiwitten te zuiveren kan dit systeem eenvoudig worden aangepast voor high-throughput screening op modulators van β-catenine afbraak.

Introduction

Xenopus laevis ei extract is uitgebreid gebruikt om vele celbiologische processen, waaronder het cytoskelet dynamiek, nucleair geheel en import, apoptose, ubiquitine metabolisme, voortgang van de celcyclus, signaaltransductie en proteïne omzet ^1-17 bestuderen. De Xenopus ei extract systeem vatbaar is voor de biochemische analyse van een legioen van cellulaire processen, omdat ei extract vertegenwoordigt in wezen onverdund cytoplasma dat alle essentiële cytoplasmatische componenten die nodig zijn om deze processen uit te voeren en in staat onderzoek bevat. Grote hoeveelheden ei extract kan worden bereid in een keer voor biochemische manipulaties die grote hoeveelheden materiaal (bijvoorbeeld eiwitzuivering of high-throughput screening) ^18-20 vereisen. Een ander voordeel is dat de concentratie van specifieke eiwitten in Xenopus ei extract nauwkeurig kan worden ingesteld door toevoeging van recombinant eiwit en / of immunodepletie van endogenous eiwitten in tegenstelling tot transfectie van plasmide-DNA waarbij expressie van het eiwit van interesse is moeilijk te controleren. Bovendien kan het gebrek aan recombinante eiwitten worden overwonnen door de toevoeging van transcripten coderend voor het eiwit van belang te maken van hoge capaciteit de vers bereide Xenopus ei extract aan toegevoegd exogeen mRNA te vertalen.

De regulering van eiwitafbraak is van cruciaal belang voor de bestrijding van vele cellulaire mechanismen en processen ^21. Xenopus ei extract is uitgebreid gebruikt om afbraak van eiwitten te bestuderen als het systeem maakt het mogelijk voor meerdere manieren om eiwitturover controleren zonder verstorende invloeden van transcriptie en vertaling. De Wnt signaleringsroute is een sterk geconserveerd signaalweg dat cruciale rol bij ontwikkeling en ziekte speelt. De omzet van β-catenine, de belangrijkste effector van de Wnt-route, is sterk gereguleerd, en een verhoogde steady-state lEvel van β-catenine is essentieel voor de activatie van de Wnt doelgenen. Het belang van β-catenine afbraak wordt benadrukt door het feit dat mutaties in de Wnt route die β-catenine afbraak remmen in ~ 90% van sporadische colorectale kanker ^22. β-catenine afbraak door componenten van de Wnt-route kan getrouw worden samengevat in Xenopus ei extract om het mechanisme van de omzet bestuderen en om nieuwe kleine molecuul modulatoren afbraakproducten ^{2, 19, 20, 23-29} identificeren.

Werkwijzen voor de bereiding van Xenopus ei extract voor het bestuderen van de celcyclus zijn beschreven in eerdere publicaties Jupiter ^30-32. Het huidige protocol beschrijft een aanpassing van deze werkwijzen en geoptimaliseerd voor de afbraak van ^[35 S]-radioactief gemerkt β-catenine en luciferase gelabeld β-catenine inXenopus ei extract. De radiogelabelde degradatie assay maakt directe visualisatie van eiwitniveaus via autoradiografie. ^[35 S] methionine wordt opgenomen in het eiwit van interesse met een in vitro translatiereactie die dan direct worden toegevoegd aan een afbraakreactie. Bovendien is het radioactief gemerkte eiwit omzet assay geen antilichaam tegen het eiwit van belang of een epitoop-tag die eiwitstabiliteit beïnvloeden vereisen. Omdat zelfs kleine veranderingen in eiwitniveaus, zoals blijkt uit veranderingen in de intensiteit van het radioactief gemerkte eiwit band, worden gemakkelijk gevisualiseerd door autoradiografie, de ^{[35S]-radioactief} degradatie assay is een zeer bruikbare werkwijze voor visualisatie eiwit omzet ^2.

Fusie van β-catenine om vuurvlieg luciferase (hierna eenvoudig "luciferase") maakt nauwkeurige en gemakkelijke kwantitatieve metingen van eiwitniveaus, teneindede kinetische eigenschappen van β-catenine omzet ^{19, 20} bepalen. Een groot voordeel van de luciferase assay is dat het een krachtig kwantitatief systeem dat gemakkelijk opgeschaald. Het volgende protocol voorziet in eenvoudige werkwijzen voor het testen β-catenine afbraak en een robuuste, efficiënte en effectieve methode voor high-throughput screening van nieuwe β-catenine modulatoren.

Protocol

1. Voorbereiding van Xenopus Egg Extract OPMERKING: Elke kikker levert ongeveer 1 ml bruikbare ei-extract. Uittreksels van 10 kikkers worden typisch bereid in een keer, en het volume buffer hieronder beschreven is voor het uitvoeren van een 10 kikker Xenopus ei extract prep. De buffer volume dienovereenkomstig kunnen hogere of lagere preparaten ei extract aangepast. Preps gegenereerd op deze wijze verkregen vaste eiwitconcentraties ≥ 50 mg / ml. Het proces van het verzamele…

Representative Results

Een schema van β-catenine afbraak in Xenopus ei extract wordt getoond in Figuur 2A. 35S-gemerkte β-catenine werd geïncubeerd in Xenopus ei extract werden porties (1 ml extract equivalent) verwijderd geëigende momenten en monsters werden onderworpen aan SDS-PAGE gevolgd door autoradiografie. β-catenine afbraak door componenten van de Wnt route wordt gemedieerd door de ubiquitine-proteasoom-systeem 2 en afbraak van [35 S]-radioactief gemerkt β-caten…

Discussion

Xenopus ei-extract is een robuust biochemisch systeem voor het onderzoeken van β-catenine omzet. De concentratie van β-catenine in Xenopus ei extract ~ 25 nM ^2. Onder optimale omstandigheden, het ei extract kan afbreken β-catenine met een snelheid van 50-100 nM / uur en half-maximaal bij 200 nM ^24. Er zijn een aantal cruciale stappen voor een succesvolle reconstructie van β-catenine afbraak berekend Xenopus ei extract. Deze omvatten 1) het genereren van hoge kwaliteit…

Materials

Name of Reagent/ Material	Company	Catalog Number	Comments/Description
Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG)	ProSpec	hor-272-A	Reconstituted with distilled water before use.
Human Chorionic Gonadotropin	Sigma	CG10-10VL
Potassium Chloride	Fisher	BP366-1
Sodium Chloride	Research Products International	S23020-5000.0
Magnesium Chloride	Fisher	BP214-500
Calcium Chloride	Acros Organics	AC42352-5000
HEPES	Fisher	BP310-1
Cysteine	Acros Organics	AC17360-1000
Leupeptin	Sigma	L2884-10MG
Aprotinin	Sigma	A1153-10MG
Pepstatin	Sigma	P4265-5MG
Cytochalasin B	Sigma	C8273-10MG
3 mL syringe: Luer Lock tip	Becton Dickinson	309657
27G1 needle	Becton Dickinson	305109
96 well solid white polystyrene microplate, round bottomed	Corning	3605
Steady-Glo Luciferase assay system	Promega	E2520	Store long-term at -80, can store for up to 1 month at -20
TNT Sp6 coupled reticulocyte lysate system	Promega	L4600
TNT Sp6 High-yield Wheat Germ protein expression system	Promega	L3260	Generally higher yield than reticulocyte lysate
EasyTag Express Protein Labeling Mix [S35]	Perkin Elmer	NEG772007MC
Creatine phosphate	Sigma	27920-5G
ATP	Sigma	A2383-5G
Creatine phosphokinase	Sigma	C3755-35KU
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma	D8418-50ML
Dual-Glo luciferase assay system	Promega	E2920	Same storage conditions as Steady-Glo
50 mL Centrifuge tubes	Fisher Scientific	0556214D
Sorvall SS-34 fixed angle rotor	Thermo Scientific	28020
115 V 50/60 Hz Minicentrifuge	Fisher Scientific	05-090-128
mMessage mMachine Sp6 kit	Ambion	AM1340
Anti-Firefly Luciferase antibody	Abcam	ab16466
Anti-GSK3 antibody	BD Transduction Laboratories	610201
Name of Equipment	Company
FLUOStar Optima	BMG Labtech
Sorvall RC-6 Plus Centrifuge	Thermo Scientific
16°C Incubator	Percival Scientific