Rekonstitution von β-Catenin-Abbau in<em> Xenopus</em> Egg Extract
Summary
Es wird ein Verfahren zur Analyse von Protein-Abbau unter Verwendung radioaktiv markiert und die Luciferase-Fusionsproteine in Xenopus-Ei-Extrakt und deren Anpassung für Hochdurchsatz-Screening für Kleinmolekül-Modulatoren der Proteinabbaus beschrieben.
Abstract
Xenopus laevis-Ei-Extrakt ist eine gut charakterisierte, robustes System zur Untersuchung der Biochemie der verschiedenen zellulären Prozessen. Xenopus-Ei-Extrakt verwendet wurde, um den Proteinumsatz in vielen zellulären Kontexten, einschließlich des Zellzyklus und der Signalübertragungswege 1-3 studieren. Hierin wird ein Verfahren zur Isolierung von Xenopus-Ei-Extrakt, das optimiert wurde, um die Verschlechterung der kritischen Wnt-Komponente, β-Catenin fördert beschrieben. Zwei verschiedene Verfahren werden beschrieben, um β-Catenin Proteinabbau in Xenopus-Ei-Extrakt zu beurteilen. Ein Verfahren ist visuell aussage ([35 S]-radioaktiv markierte Proteine), während das andere leichter für Hochdurchsatz-Assays (Firefly-Luciferase-markierte Fusionsproteine) skaliert. Die beschriebenen Techniken können dazu verwendet werden, ein, sind aber nicht darauf beschränkt, zu beurteilen β-Catenin-Protein zu identifizieren und Umsatz molekularen Komponenten beiträgt, den Umsatz. Zusätzlich wird die Fähigkeit, um große Mengen von homogenen Xenopus-Ei-Extrakt in Kombination mit der quantitativen und einfache Auslesung der Luciferase-markierte Proteine zu reinigen, ermöglicht dieses System leicht für Hochdurchsatz-Screening auf Modulatoren von β-Catenin Abbau angepasst werden.
Introduction
Xenopus laevis-Ei-Extrakt wurde ausgiebig verwendet, um viele Zell biologischen Prozessen einschließlich Zytoskeletts, Kernanordnung und Import, Apoptose, Ubiquitin-Stoffwechsel, Zellzyklus-Progression, Signaltransduktion und Proteinumsatz 1-17 studieren. Die Xenopus-Ei-Extrakt-System ist offen für die biochemische Analyse einer Legion von zellulären Prozessen, weil Ei-Extrakt stellt im Wesentlichen unverdünnt Zytoplasma, die alle wesentlichen Komponenten zytoplasmatischen notwendig, diese Prozesse auszuführen und ermöglichen Untersuchung enthält. Große Mengen von Ei-Extrakt kann auf einmal zur biochemischen Manipulationen, die große Mengen von Material (z. B. Proteinreinigung oder Hochdurchsatz-Screening) 18-20 erfordern, hergestellt werden. Ein weiterer Vorteil ist, dass die Konzentration von spezifischen Proteinen in Xenopus-Ei-Extrakt kann präzise durch Zugabe von rekombinantem Protein und / oder der Immunodepletion ENDOG eingestellt werdenenous Proteine im Gegensatz zur Transfektion von Plasmid-DNA, wobei die Expression des Proteins von Interesse ist schwierig zu steuern. Darüber hinaus kann der Mangel an verfügbaren rekombinanten Proteinen durch die Zugabe von Transkripten, die das Protein von Interesse kodiert, überwunden werden, unter Ausnutzung der hohen Kapazität der frisch hergestellten Xenopus-Ei-Extrakt zur exogen zuge mRNA zu übersetzen.
Die Regulation der Proteinabbau ist entscheidend für die Steuerung vieler zelluläre Wege und Prozesse 21. Xenopus-Ei-Extrakt wurde ausgiebig verwendet, um den Proteinabbau zu untersuchen, wie das System erlaubt mehrere Möglichkeiten, um den Proteinumsatz ohne verwirrende Einflüsse der Transkription und Translation kontrollieren. Der Wnt-Signalweg ist eine hoch konservierte Signalweg, der eine entscheidende Rolle in der Entwicklung und Krankheit spielt. Der Umsatz von β-Catenin, der Haupt Effektor des Wnt-Signalwegs, ist stark reguliert, und eine erhöhte Steady-State-level von β-Catenin ist entscheidend für die Aktivierung der Wnt-Zielgene. Die Bedeutung der β-Catenin-Abbau wird durch die Tatsache, dass Mutationen im Wnt-Signalweg, die β-Catenin-Abbau hemmen, gefunden in ~ 90% der sporadischen Fälle von Darmkrebs 22 hervorgehoben. β-Catenin-Abbau durch Komponenten des Wnt-Signalwegs getreu in Xenopus-Ei-Extrakt rekapituliert, um den Mechanismus des Umsatzes zu studieren sowie neuartiger niedermolekularer Modulatoren von seiner Abbau 2, 19, 20, 23-29 zu identifizieren.
Verfahren zur Herstellung von Xenopus-Ei-Extrakt zur Untersuchung der Zellzyklus sind in früheren Veröffentlichungen JoVE 30-32 beschrieben. Das derzeitige Protokoll beschreibt eine Modifikation dieser Verfahren und ist für den Abbau von optimierten [35 S]-radioaktiv markierten β-Catenin und die Luciferase-markierten β-Catenin inXenopus-Ei-Extrakt. Das radioaktiv markierte Abbau-Assay ermöglicht die direkte Visualisierung von Protein-Ebene über Autoradiographie. [35 S]-Methionin in das Protein von Interesse unter Verwendung eines in vitro-Translationsreaktion, die dann direkt auf eine Abbaureaktion zugegeben werden kann, eingebaut. Darüber hinaus ist das radioaktiv markierte Proteinumsatz-Assay erfordern einen Antikörper gegen das Protein von Interesse oder ein Epitop-Tag, das die Proteinstabilität beeinflussen. Da selbst kleine Veränderungen in der Proteinniveaus, wie in Änderungen der Intensität des radioaktiv markierten Proteinbande reflektiert, werden leicht durch Autoradiographie sichtbar gemacht, die [35 S]-radioaktiv markierte Abbauassay stellt ein sehr nützliches Verfahren zur Visualisierung des Proteinumsatzes 2.
Fusion von β-Catenin an Leuchtkäfer-Luciferase (im folgenden einfach als "Luciferase" genannt) ermöglicht eine genaue und einfache quantitative Messung der Proteinspiegel, umum die kinetischen Eigenschaften der β-Catenin-Umsatz 19, 20 zu bestimmen. Ein wesentlicher Vorteil der Luciferase-Assay ist, dass es eine starke quantitative System, in dem bis skaliert wird. Das folgende Protokoll bietet einfache Methoden zur Bestimmung von β-Catenin-Abbau und eine robuste, effiziente und effektive Methode für die Hochdurchsatz-Screening von neuen β-Catenin-Modulatoren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Xenopus-Ei-Extrakt ist ein robustes System für die Untersuchung von biochemischen β-Catenin-Umsatzes. Die Konzentration von β-Catenin in Xenopus-Ei-Extrakt 25 ~ 2 nM. Unter optimalen Bedingungen ist die Ei-Extrakt, der zum Abbau β-Catenin mit einer Geschwindigkeit von 50-100 Nm / h und ist halb-maximal bei 200 nM 24. Es gibt mehrere wichtige Schritte für eine erfolgreiche Wiederherstellung der β-Catenin-Abbau unter Verwendung von Xenopus-Ei-Extrakt. Dazu gehören 1)…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Laurie Lee für das kritische Lesen des Manuskripts. TWC wird von einem American Heart Association Promotionsstipendium (12PRE6590007) unterstützt. MRB wird von einem National Cancer Institute Ausbildungsförderung (T32 CA119925) unterstützt. SSH ist National Institutes of Health (R01DK078640) unterstützt. EL wird von den National Institutes of Health (R01GM081635 und R01GM103926) unterstützt.
Materials
| Name of Reagent/ Material | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG) | ProSpec | hor-272-A | Reconstituted with distilled water before use. |
| Human Chorionic Gonadotropin | Sigma | CG10-10VL | |
| Potassium Chloride | Fisher | BP366-1 | |
| Sodium Chloride | Research Products International | S23020-5000.0 | |
| Magnesium Chloride | Fisher | BP214-500 | |
| Calcium Chloride | Acros Organics | AC42352-5000 | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Cysteine | Acros Organics | AC17360-1000 | |
| Leupeptin | Sigma | L2884-10MG | |
| Aprotinin | Sigma | A1153-10MG | |
| Pepstatin | Sigma | P4265-5MG | |
| Cytochalasin B | Sigma | C8273-10MG | |
| 3 mL syringe: Luer Lock tip | Becton Dickinson | 309657 | |
| 27G1 needle | Becton Dickinson | 305109 | |
| 96 well solid white polystyrene microplate, round bottomed | Corning | 3605 | |
| Steady-Glo Luciferase assay system | Promega | E2520 | Store long-term at -80, can store for up to 1 month at -20 |
| TNT Sp6 coupled reticulocyte lysate system | Promega | L4600 | |
| TNT Sp6 High-yield Wheat Germ protein expression system | Promega | L3260 | Generally higher yield than reticulocyte lysate |
| EasyTag Express Protein Labeling Mix [S35] | Perkin Elmer | NEG772007MC | |
| Creatine phosphate | Sigma | 27920-5G | |
| ATP | Sigma | A2383-5G | |
| Creatine phosphokinase | Sigma | C3755-35KU | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418-50ML | |
| Dual-Glo luciferase assay system | Promega | E2920 | Same storage conditions as Steady-Glo |
| 50 mL Centrifuge tubes | Fisher Scientific | 0556214D | |
| Sorvall SS-34 fixed angle rotor | Thermo Scientific | 28020 | |
| 115 V 50/60 Hz Minicentrifuge | Fisher Scientific | 05-090-128 | |
| mMessage mMachine Sp6 kit | Ambion | AM1340 | |
| Anti-Firefly Luciferase antibody | Abcam | ab16466 | |
| Anti-GSK3 antibody | BD Transduction Laboratories | 610201 | |
| Name of Equipment | Company | ||
| FLUOStar Optima | BMG Labtech | ||
| Sorvall RC-6 Plus Centrifuge | Thermo Scientific | ||
| 16°C Incubator | Percival Scientific |
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