En fuld huddefekten model til evaluering Vaskularisering biomaterialer<em> In Vivo</em

Summary

Vaskularisering er nøglen til tilgange i vellykket tissue engineering. Derfor er pålidelige teknologier nødvendige for at vurdere udviklingen af ​​vaskulære netværk i væv-konstruktioner. Her præsenterer vi en enkel og omkostningseffektiv metode til at visualisere og kvantificere vaskularisering in vivo.

Abstract

Utilstrækkelig vaskularisering anses for at være en af ​​de vigtigste faktorer, der begrænser den kliniske succes for væv-manipuleret konstruktioner. For at vurdere nye strategier, der sigter mod at forbedre vaskularisering, er pålidelige metoder kræves for at gøre det i vækst af nye blodkar i bio-kunstige stilladser synlige og kvantificere resultaterne. Gennem de seneste par år, har vores gruppe indført et komplet hud defekt model, der gør det muligt direkte visualisering af blodkar ved gennemlysning og giver mulighed for kvantificering via digital segmentering. I denne model, en kirurgisk skaber fuld overfladefejl i ryggen af ​​mus og erstatter dem med det afprøvede materiale. Molekyler eller celler af interesse kan også indgå i sådanne materialer til at studere deres potentielle effekt. Efter en observationstid på ens egen valg, materialer eksplanteret til evaluering. Bilaterale sår giver muligheden for at gøre de interne sammenligninger thved minimering af artefakter mellem individer samt mindske antallet af dyr, der er nødvendige for undersøgelsen. I sammenligning med andre fremgangsmåder, vores metode giver en enkel, pålidelig og omkostningseffektiv analyse. Vi har implementeret denne model som en rutine værktøj til at udføre høj opløsning screening ved test vaskularisering af forskellige biomaterialer og bio-aktivering tilgange.

Introduction

I de seneste årtier har tissue engineering åbnet en ny terapeutisk mulighed for at erstatte vævsdefekter med kroppens egne celler ^1. For at støtte den fysiologiske proces vævsregenerering er stilladser udformet som en bionedbrydelig struktur, der giver et scenarie, hvor celler fra sårlejet kan vokse og genoprette defekten ^2,3.

Utilstrækkelig vaskularisering anses for at være den største hindring, som holder tilbage den kliniske gennembrud Bioartificial stilladser ^4. Med indvækst af celler, bliver væsentlig efterspørgsel efter næringsstoffer og ilt stiger, og vaskularisering af materialet. Utilstrækkelig eller forsinket vaskularisering kan derfor føre til central nekrose af væv-manipuleret ^5. Desuden blodkar forsyner immunkompetente celler og fjerne de metaboliske rester i regenererende område. Høje infektion satser og lav regenerering er kunnogle af konsekvenserne af utilstrækkelig blodperfusion observeret i tissue engineering, der har til formål at afværges ved at øge vaskularisering af stilladser ^6,7.

Adskillige strategier, der sigter mod at forbedre vaskularisering fokus på den centrale rolle, biomaterialet selv og mikrostruktur af stilladset. Der er intensiv forskning bestræbelser på at udvikle nye tilgange i skiftende helingsprocessen fra reparation til regenerering, og dermed (gen) generere en væv med de nærmeste fysiologiske egenskaber til en, der skal genoprettes ^8,9. Biomaterialer, der blev undersøgt og evalueret med hensyn til deres regenerative potentiale inkluderet kollagen, fibrin, chitosan og alginat ^10,11. Disse biomaterialer kan bruges og kombineres som en rygrad til at bygge nye stilladser ved hjælp af forskellige strategier såsom væv decellularization, self-assembly, rapid prototyping og electrospinning ^12. For at ENHstemmelse kroppens egen regenerationsevne kan stilladser blive bioaktiveres. Inkorporeringen af rekombinant angiogene vækstfaktorer ¹³ eller gen vektorer, der koder for sådanne faktorer, ¹⁴ har vist sig at forbedre vaskularisering af stilladset. Anvendelsen af stamceller er i vid udstrækning blevet vist at være en lovende strategi til forbedring vaskularisering, hvor mesenchymale stromale celler og endotheliale progenitorceller har fået mest opmærksomhed ^15,16. Andre tilgange forsøger at bygge konstruktioner, der indeholder præfabrikerede netværk fartøj før transplantation ^17. Trods intensiv indsats i stillads design og deres bio-aktivering, har ingen strategi forbedret vaskularisering ved et klinisk signifikant niveau, og med undtagelse af dermale udskiftninger i massive forbrændinger, er oversættelsen af gensplejsede materialer i klinisk rutine kun finder sted tøvende ¹⁸ .

En af grundene til, at vaskulariseringaf kunstige vævskonstruktioner er stadig et uløst problem, er vanskeligheden ved at evaluere resultaterne af nye teknologier i in vivo-metoder. Selvom in vitro-forsøg kan give vigtige indsigter vaskulariseringen potentiale stilladser, er egnede dyremodeller der kræves for at studere centrale parametre såsom biokompatibilitet af materialet, sikkerhed og effekt af behandlingen, og af særlig betydning, at vaskularisering af vævet konstruere. Derfor er pålidelige værktøjer visualisere og kvantificere blodkar netværk in vivo er afgørende.

I denne undersøgelse præsenterer vi en enkel og pålidelig metode, der tillader visualisering og kvantificering af det vaskulære netværk inde eksplanterede stillads. Denne metode er baseret på væv gennemlysning og digital segmentering. Da denne metode er ikke-invasiv, det giver mulighed for yderligere molekylære og histologiske analyser af målmaterialet.

Protocol

1. Fremstilling af stilladser Generer prøver af stilladser ved hjælp af 12 mm biopsi slag. At introducere bioaktive molekyler eller celler i stillads, dræne stilladser ved forsigtigt at klemme dem med en steril gaze. Derefter rehydrere stilladser ved tilsætning af 160 pi af en opløsning indeholdende de bioaktive molekyler eller celler af interesse. Dobbelt-tjek succes bioaktivering med celler gennem metaboliske assays, såsom MTT assays. Hvis det er nødvendigt, fastsætte forbindelse…

Representative Results

Der kan skabes en pålidelig bilateral fuld hud defekt i mus (figur 1), hvor huden kan erstattes af et biomateriale under undersøgelse (figur 2). Her er ingen større komplikationer under eller efter den operative procedure, hverken makroskopiske tegn på infektion eller udenlandsk organ reaktion. I sjældne tilfælde, bliver et stillads tabt, når en mus fjerner det. Sårkontraktion blev aldrig observeret (figur 3). Tissue gennemlysning tilladt klar visualisering af v…

Discussion

Der er behov for at etablere vellykkede tilgange til at forbedre blodperfusion i manipuleret væv konstruktioner, som kræver udvikling af nye pålidelige metoder til at studere vaskulariseringen processer inden for biomaterialer. Almindelige metoder til fremstilling stillads vaskularisering ex vivo synlig indbefatter anvendelse af mikroskopi, som giver en høj opløsning værktøj. I de fleste tilfælde, selv om denne metode er begrænset til analyse af små vævs områder, og har tendens til at være dyrt og …

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Ethilon P-3 13 mm 3/8 circle 5-0	Ethicon, Norderstedt, Germany	698G	Ethilon polyamid-6 precision point-reverse cutting suture
Biopsy punches (10 mm)	Xiomedics, Acuderm inc., Fort Lauderdale, FL, USA	P1050
Biopsy punches (12 mm)	Xiomedics, Acuderm inc., Fort Lauderdale, FL, USA	P1250
Digital camera	Ricoh, Hannover, Germany	Cx1
Gazin Mullkompresse	Lohmann und Rauscher, Neuwied, Germany	13622	Sterile gauze (10 cm x 10 cm)
Double-layer collagen-based scaffold (8 'x 10')	Integra Life Science Corporation, Plainsboro, NJ, USA	88101
Isoflurane, liquid-gas for inhalative anesthesia	Baxter, Unterschleissheim, Germany	100196040
Pentobarbital, 16 g / 100 ml	Fa. Merial, Hallbergmoos
Nuri Nu/Nu Nude mice, CrLNU-Foxn1nu	Charles River, Sulzfeld, Germany	Strain code 088	Athymic nude mice, 6 to 8 weeks of age and with a body weight between 20 to 25 g
Buprenorphine (0.3 mg/ml)	Essex Pharma GmbH, Munich, Germany
Titanized mesh (15 cm x 15 cm), extralight	PFM Medical AG, Köln, Germany	6000029
Tissucol Duo S Immuno 2 ml	Baxter Germany GmbH, Unterschleißheim, Germany	B1332020110614	Fibrin-thrombin solution
Transparent adhesove drape (30.5 cm x 26 cm)	KCI Medical Products, Wimborne Dorset, UK	M6275009/10