유도 된 신경 세포로 성숙한 인간 두뇌의 혈관 주위 세포에서 파생 된 세포의 리니지 - 프로그래밍
Summary
직접 혈통 프로그래밍에 대한 뇌 상주 세포를 표적으로하는 것은 뇌 수리에 대한 새로운 관점을 제공합니다. 여기서 우리는 성인의 대뇌 피질에서 뇌에 상주하는 혈관 주위 세포에 풍부한 문화를 준비하고 SOX2 및 Ascl1 요인 전사의 레트로 바이러스 매개 식에 의해 유도 된 신경 세포로 이러한 변환하는 방법의 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
유도 된 신경 세포 (INS)에 비 신경 세포의 직접 혈통 프로그래밍은 신경의 근간이되는 분자 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하고 체외 모델링하거나 병에 걸린 뇌를 복구하기위한 새로운 전략을 가능하게 할 수있다. INS로 직접 변환 의무 식별 뇌 상주 비 신경 세포 유형은 손상된 뇌 조직 내에서, 즉, 현장에서 이러한 접근 방식을 실행을 허용 할 수 있습니다. 여기에서 우리는이 전제를 충족 성인의 뇌에서 파생 된 세포를 식별하는 시도에서 개발 된 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 수반 : 성인 인간의 뇌 생검 의한 대뇌 피질에서 인간 세포의 (1)를 배양; (2) 시험 관내 (약 2-4주 필요) 확장 및 면역 세포에 의해 문화의 특성 및 유동 세포 계측법; (3) 항 PDGF 수용체 β 및 안티 CD146 항체를 사용하여 (FACS)를 정렬 형광 활성화 된 셀에 의해 농축;(4) 신경성 전사와 레트로 바이러스 매개 전달은 SOX2 및 ascl1 요인; (5) 마지막으로 면역 세포에 의해 생성 된 혈관 주위 세포 유래 유도 된 신경 세포 (PdiNs)의 특성 (8 주 14 일 레트로 바이러스 형질 도입에 따라). 이 단계에서, 인은 패치 클램프 녹음하여 전기적 특성에 대해 탐색 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 기능적인 인간의 기능에 뇌 상주 혈관 주위 세포의 체외 혈통 전환에 대한 높은 재현성 절차를 제공합니다.
Introduction
다시 분화 가능성의 과다 부여하는 유도 만능 줄기 세포로 체세포 (유도 만능), 프로그래밍과 달리, 직접 프로그래밍은 다른에 하나의 특정 세포 유형의 연속 변환을 위해 목표로하고있다. 질병 모델링 및 잠재적 인 세포 기반 치료의 맥락에서 자신의 응용 프로그램에 대해, 모두 프로그래밍 방식은 특정 장점과 단점이 있습니다. 유도 만능 (I)에 프로그램을 다시 만들 것은 세포의 거의 무한한 소스를 제공한다; (II) 유전 공학을 허용한다; (III) 거의 무제한의 분화 가능성에 부여한다. 이러한 세포는 세포 기반 치료에 사용되어야하는 경우에는 유도 만능의 주요 단점은 미분화 세포 (생체 내에서 기형 종 형성)의 발암 및 생체 외 배양과 후속 이식을위한 필요성의 위험을 수반한다. 반대로, 직접 혈통 프로그래밍은 원하는 세포의 낮은 수율에 의해 제한됩니다출발 인구의 표적 세포의 수와 직접 관련이 있지만, 계통 – 리 프로그래밍 세포 이식 1,2에 제공된 발암 위험을 나타내지하지 나타나는 장점을 보유하는; 또한, 직접 프로그래밍도, 즉 이들 세포는 따라서 이식 필요성을 피하고, 필요한 것 장기 내에, 동일계에서 달성 될 수있다.
이 염두에두고, 우리의 실험실은 신경 퇴행성 질환의 세포 기반 치료법을 향한 새로운 접근 방식으로 기능에 혈통 재 프로그래밍 뇌 상주 세포의 가능성을 추구하고있다. 잠재적 혈통 프로그래밍 셀룰러 대상으로 고려 될 수있다 뇌 상주 세포는 다른 macroglia의 유형 (성상 세포, NG2 세포 및 희소 돌기 아교 세포), 미세 아교 세포 및 미세 혈관 관련 세포 (내피 세포와 혈관 주위 세포)를 포함한다. 우리는 광범위하게 대뇌 고전의 아스트로의 체외 프로그램을 다시 만들 가능성을 연구 한출생 초기 마우스 3-5 텍스. 성인의 뇌에 직접 혈통 프로그래밍에 대한 유사 적합한 세포 소스의 검색, 우리는 성공적으로 기능과 혈관 주위 세포의 전시 품질 증명으로 다시 프로그램 할 수있는 세포 인구가 발생했습니다. 여기에서 우리는 확장하고 체외에서이 세포를 풍부하게, 그리고 마지막으로 성공적으로 (25 ~ 30 % 범위)이 체외 확장 된 세포의 상당 부분을 재 프로그램하는, 성인의 뇌 조직 검사에서 이러한 세포를 수확하는 방법에 대한 프로토콜을 설명 기능. 리 프로그래밍은 두 개의 전사 인자, SOX2 및 ascl1 동시에 레트로 바이러스 – 매개의 공동 발현에 의해 달성 될 수있다. 이러한 PdiNs는 반복적 활동 전위 소성 능력을 취득하고 신경망으로 통합 그들의 능력을 나타내는 다른 뉴런뿐만 시냅스 대상 서브 밝혀졌다. 우리의 프로토콜은 기능에 성인의 뇌 혈관 주위 세포의 분리 및 혈통 전환을위한 간단한 절차를 제공합니다. </P>
Protocol
Representative Results
Discussion
본 프로토콜은 체외 확장과 농축 혈관 주위 세포에서 파생 된 세포의 성인 인간의 대뇌 피질에서 분리 다음과 신경성 전사의 레트로 바이러스 매개로 표현하여 기능에 후속 변환 SOX2 및 Ascl1 요인에 대해 설명합니다. 이러한 프로토콜은 궁극적으로 성인 뇌의 생체 설정으로이 직접 변환 방식을 번역하는 마음에서 목표로, 잠재적으로 glia의 신경에 두뇌 상주 세포의 혈통 변환 등을 연…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는이 프로토콜을 개발하는 동안 그녀의 입력을위한 박사 막달레나 Götz가에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 관대 SOX2의 코딩 서열을 저희에게 제공하는 박사의 Marius Wernig (스탠포드 대학) 감사합니다. 우리는 또한 바이러스 생산을위한 박사 알렉산드라 Lepier에 매우 감사하고 있습니다. 이 작품은 독일 Forschungsgemeinschaft (4182/2-2 BE)와 BMBF (01GN1009A) BB, 그리고 과학의 바이에른 주 정부, 연구 및 MK와 BBCS에 예술이 양국 SYSTHER-로부터받은 자금의 보조금에 의해 지원되었다 INREMOS 가상 연구소 (교육과 연구의 독일과 슬로베니아어 연방 부처) 및 DFG (SFB 824).
Materials
| anti-CD140b-PE | BD Biosciences | 558821 | use 1:100 |
| anti-CD146-FITC | AbD Serotec | MCA2141FT | use 1:100 |
| anti-CD13-FITC | AbD Serotec | MVA1270A488T | use 1:100 |
| anti-CD34-APC | BD Biosciences | 560940 | use 1:100 |
| anti-PDGFRβ | Cell Signaling | 3169S | use 1:200 |
| anti-CD146 | Abcam | Ab75769 | use 1:400 |
| anti-NG2 | Millipore | AB5320 | use 1:400 |
| anti-SMA | Sigma-Aldrich | A2547 | use 1:400 |
| anti-βIII-tubulin | Sigma-Aldrich | T8660 | use 1:400 |
| anti-MAP2 | Sigma-Aldrich | M4403 | use 1:200 |
| anti-GFAP | Sigma-Aldrich | G3893 | use 1:600 |
| anti-GFP | Aves Labs | GFP 10-20 | use 1:1000 |
| anti-RFP | Chromotek | 5F8 | use 1:500 |
| anti-S100β | Sigma-Aldrich | S2532 | use 1:300 |
| anti-NeuN | Millipore | MAB377 | use 1:200 |
| anti-GABA | Sigma-Aldrich | A2052 | use 1:500 |
| anti-Calretinin | Millipore | AB5054 | use 1:500 |
| anti-vGluT1 | SYnaptic SYstems | 135511 | use 1:1000 |
| Rat IgG1 isotype control FITC | AbD Serotec | 11-4301-81 | use 1:100 |
| Rat IgG1 isotype control PE | AbD Serotec | 12-4301-81 | use 1:100 |
| Rat IgG1 isotype control APC | AbD Serotec | 17-4301-81 | use 1:100 |
| TrypLE | Invitrogen | 12605-010 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX | Invitrogen | 61965 | |
| B27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504044 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10106-169 | perform heat inactivation by incubation at 56 °C for 30 min |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) | Invitrogen | 24020-091 | |
| Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS, 1×; Invitrogen, cat. no. 14190) | Invitrogen | 14190 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| PFA (paraformaldehyde) | Sigma-Aldrich | P1648 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| DAPI (4′,6-Diamidin-2-phenylindole) dilactate | Sigma-Aldrich | 042M4005 | |
| Aqua-Poly/Mount | Polysciences | 18606-20 | |
| Polypropylene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| Polystyrene round-bottom tubes with cell-strainer cap | BD Biosciences | 352235 | |
| 24-well plates | Orange Scientific | 5530305 | |
| 75 cm2 culture flasks | Greiner Bio-One | 658175 | |
| 25 cm2 culture flasks | Greiner Bio-One | 690175 | |
| Disposable pipettes 10 ml | Sarstedt | ######### | |
| Glass Pasteur pipettes (150 mm) | Fisherbrand | FB50251 | |
| Glass coverslips 12 mm diameter | Menzel | CB00120RA1 | |
| Surgical disposable scalpels | B. Braun | 5518083 | |
| Tissue culture dishes | Greiner Bio-One | 633180 | |
| Conical tubes 15ml | BD Biosciences | 352095 | |
| Laminar flow hood | |||
| Centrifuge and swing-out rotor with adapters for 15 ml and 50 ml tubes | Hettich Lab Technology | 1406 | |
| Flow cytometry cell sorter: FACSAria l with FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| Humified cell culture incubator | Eppendorf Galaxy 170R | ||
| Wather bath at 37 °C | |||
| FACSFlow sheath fluid | BD Biosciences | 342003 | |
| Epifluorescence microscope BX61 | Olympus | ||
| Confocal microscope LSM710 | Zeiss |
References
- Caiazzo, M., et al. Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. Nature. 476, 224-227 (2011).
- Kim, J., et al. Functional integration of dopaminergic neurons directly converted from mouse fibroblasts. Cell stem cell. 9, 413-419 (2011).
- Duan, B., et al. Interactions between water deficit, ABA, and provenances in Picea asperata. Journal of experimental botany. 58, 3025-3036 (2007).
- Heinrich, C., et al. Directing astroglia from the cerebral cortex into subtype specific functional neurons. PLoS Biol. 8, (2010).
- Heinrich, C., et al. Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex. Nat Protoc. 6, 214-228 (2011).
- Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells. J Vis Exp. , (2007).
- Karow, M., et al. Reprogramming of pericyte-derived cells of the adult human brain into induced neuronal cells. Cell stem cell. 11, 471-476 (2012).
- Ortega, F., et al. Using an adherent cell culture of the mouse subependymal zone to study the behavior of adult neural stem cells on a single-cell level. Nat Protoc. 6, 1847-1859 (2011).
- Ladewig, J., et al. Small molecules enable highly efficient neuronal conversion of human fibroblasts. Nat Methods. 9, 575-578 (2012).
- Espuny-Camacho, I., et al. Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo. Neuron. 77, 440-456 (2013).
- Davila, J., Chanda, S., Ang, C. E., Sudhof, T. C., Wernig, M. Acute reduction in oxygen tension enhances the induction of neurons from human fibroblasts. J Neurosci Methods. 216, 104-109 (2013).
- Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463, 1035-1041 (2010).
- Pfisterer, U., et al. Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 10343-10348 (2011).
- Lu, J., et al. Generation of Integration-free and Region-Specific Neural Progenitors from Primate Fibroblasts. Cell Rep. 3, 1580-1591 (2013).
- Yang, N., Ng, Y. H., Pang, Z. P., Sudhof, T. C., Wernig, M. Induced neuronal cells: how to make and define a neuron. Cell Stem Cell. 9, 517-525 (2011).
- Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476, 220-223 (2011).
- Yoo, A. S., et al. MicroRNA-mediated conversion of human fibroblasts to neurons. Nature. 476, 228-231 (2011).
- Son, E. Y., et al. Conversion of mouse and human fibroblasts into functional spinal motor neurons. Cell Stem Cell. 9, 205-218 (2011).
- Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 2527-2532 (2012).
- Thier, M., et al. Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells. Cell Stem Cell. 10, 473-479 (2012).
- Yang, N., et al. Generation of oligodendroglial cells by direct lineage conversion. Nat Biotechnol. 31, 434-439 (2013).
- Najm, F. J., et al. Transcription factor-mediated reprogramming of fibroblasts to expandable, myelinogenic oligodendrocyte progenitor cells. Nat Biotechnol. 31, 426-433 (2013).
