Summary

Kaynaklı Nöronlar içine Yetişkin İnsan Beyninin perisit türetilmiş Hücreler Lineage yeniden programlama

Published: May 12, 2014
doi:

Summary

Doğrudan soy-yeniden programlama için beyin-yerleşik hücreleri hedef beyin onarımı için yeni perspektifler sunuyor. Burada yetişkin insan serebral korteks beyin-yerleşik perisitlerden için zenginleştirilmiş kültürleri hazırlamak ve Sox2 ve Ascl1 faktörleri transkripsiyon retrovirüs aracılı ifade tarafından uyarılan nöronların bu dönüştürmek için nasıl bir protokol açıklar.

Abstract

Uyarılan nöronların (INS) içine non-nöronal hücrelerin doğrudan soy-yeniden programlama nörogenezi altında yatan moleküler mekanizmaları içgörü sağlamak ve in vitro modelleme veya hastalıklı beyin tamiri için yeni stratejiler etkinleştirebilirsiniz. Ins içine doğrudan dönüşüm için müsait belirlenmesi beyin-yerleşik olmayan nöronal hücre tipleri hasarlı beyin dokusu içinde, yani yerinde böyle bir yaklaşımı başlatılması için izin verebilir. İşte bu öncül yerine yetişkin insan beyninden türetilen hücrelerin teşhis etmek için bir girişimde gelişmiş bir protokol açıklar. Bu protokol şunları içerir:, yetişkin insan beyin biyopsileri elde serebral korteks, insan hücreleri (1) kültürlenmesini; (2) in vitro (yaklaşık 2-4 hafta gerektiren) genleşme ve immunositokimya ile kültür karakterizasyonu ve akış sitometrisi; (3) anti-PDGF reseptörü β-ve anti-CD146 antikorları kullanılarak (FACS) floresan-aktive edilmiş hücre ile zenginleştirme;(4), nörojenik transkripsiyonuna retrovirüs aracılı iletim ve Sox2 ascl1 faktörleri; (5) ve son olarak, bağışıklık kimyası edilen perisit türetilmiş kaynaklı nöron (PdiNs) 'nin karakterizasyonu (8 hafta için 14 gün retroviral iletimini sonra). Bu aşamada, ins yama kelepçe kayıt kendi elektriksel özellikleri için tanınacak. Bu protokol, fonksiyonel insan ins içine beyin yerleşik perisitler in vitro soy dönüşüm için son derece tekrarlanabilir prosedürü sağlar.

Introduction

Da farklılaşma potansiyel bir bolluk ile donatılmış bulunmaktadır uyarılmış pluripotent kök hücreleri içine somatik hücreler (iPSCs), yeniden programlamayı aksine, doğrudan yeniden programlama başka içine belirli bir hücre tipi düz dönüşüm için amaçlanmıştır. Hastalık modelleme ve potansiyel hücre bazlı terapiler bağlamında kendi uygulama ile ilgili olarak, her ikisi de yeniden programlama yaklaşımlar belirli avantajları ve dezavantajları vardır. IPSCs (i) yeniden programlama hücrelerin neredeyse sonsuz bir kaynak içerir; (Ii) genetik mühendisliği için izin verir; (Iii) a, neredeyse sınırsız farklılaşma potansiyele sahip endows. Bu hücreler, hücre bazlı terapiler için kullanılacak olan, ancak, iPSCs önemli dezavantajları farklılaşmamış hücreleri (in vivo teratoma formasyonu) tümöre neden olması ve ex vivo yetiştirme ve müteakip transplantasyon için ihtiyaç risk taşımaktadır. Buna karşılık, direkt soy yeniden programlama arzu edilen hücrelerin düşük verim tarafından kısıtlanırBaşlangıç ​​nüfusun hedef hücrelerin sayısı ile doğrudan ilişkili, ancak soy programlanabilir hücre nakli 1,2 üzerinde herhangi bir tümör oluşturucu bir risk sergilemek için görünür avantajına sahiptir ki; ayrıca, doğrudan yeniden programlama da örneğin, bu hücrelerin bu şekilde nakli ihtiyacını ortadan kaldırmak, gerekli olacaktır organ içinde, in situ sağlanabilir.

Bu düşünceyle, bizim laboratuvar nörodejeneratif hastalıkların hücre bazlı terapiler yönelik yeni bir yaklaşım olarak ins içine soy-yeniden programlanması beyin yerleşik hücrelerinin olasılığını izlemiştir. Potansiyel olarak soy tekrar programlanması için, hücresel hedefler olarak kabul edilebilir Brain yerleşik hücreler farklı macroglia türleri (astrositler, NG2 hücreleri ve oligodendrosit), mikroglia ve mikrovasküler ilişkili hücrelerin (endotelyal hücreler ve perisitler) içerir. Biz kapsamlı serebral kor astroglial in vitro yeniden programlama potansiyel inceledikErken doğum sonrası farelerin 3-5, tex. Yetişkin insan beyninde doğrudan soy-yeniden programlama için benzer uygun hücre kaynakları arayışı içinde, başarıyla INS ve perisitlerin sergi işaretlerinden içine programlanabilir bir hücre popülasyonu karşılaştı. Burada genişletmek ve in vitro olarak bu hücreleri zenginleştirmek ve son olarak da başarılı bir şekilde içine (% 25-30 aralığında), bu in vitro genişletilmiş hücreleri önemli bir kısmını yeniden programlamak için, yetişkin insan beyni biyopsilerinden bu hücrelerin hasat için nasıl bir protokol açıklar INS. Tekrar-iki transkripsiyon faktörleri, Sox2 ve ascl1 eşzamanlı retrovirüs aracılı ko-ifade ile elde edilebilir. Bu PdiNs tekrarlayan aksiyon potansiyeli ateşleme yeteneğini kazanmak ve sinir ağları içine entegre kabiliyetlerini gösteren diğer nöronlar gibi sinaptik hedeflere hizmet bulundu. Bizim protokol ins içine yetişkin insan beyni perisitler izolasyon ve soy dönüşüm için basit bir prosedürü sağlar. </p>

Protocol

1.. İzolasyon ve Yetişkin İnsan Beyin Hücrelerinin ekimi Insan dokusu ile ilgili deneyler araştırma amacıyla insan malzeme kullanımı ilgili tüm devlet ve kurumsal düzenlemelere uygun olarak yapılmalıdır. Mevcut protokol LMU Münih Tıp Fakültesi etik kurulu ve tüm hastalardan yazılı onam tarafından onayı doğrultusunda geliştirilmiştir. Insan yetişkin beyin korteks hazırlanması kültürlerinin Bu protokol, temporal lob epilepsi ya da diğer…

Representative Results

Bu protokol sonra başarılı bir şekilde insan yetişkin beyin korteksi bir örnekten bir kültür oluşturulması ilk sonuç kültürün hücre bileşimin tanımlanması oluşur. Hücre tipi özel proteinler için İmmünositokimya farklı hastalar (Şekil 1A) numune türetilen kültürleri arasında heterojenite önemli derecede ortaya koymaktadır. Akış sitometrisi ile belirlenir olarak (ortalama olarak ~% 75, 30 ile en fazla% 99 kadar) PDGFRβ eksprese eden hücrelerin önemli bir kısmı her za…

Discussion

Bu protokol in vitro genişlemesi ve zenginleştirme perisit türetilen hücrelerin yetişkin insan serebral korteksinden izole takip eden ve nörojenik transkripsiyon retrovirüs aracılı ifade tarafından INS içine sonraki dönüşüm ve Sox2 Ascl1 faktörleri açıklamaktadır. Anılan protokol, sonuçta yetişkin beyninin in vivo ortam haline doğrudan dönüşüm yaklaşımı çevirmek için akılda hedefi ile, potansiyel olarak da glia nöronların içine beyin-yerleşik hücrelerinin soy-dön?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz bu protokolün geliştirilmesi sırasında onu girişi için Dr Magdalena Götz minnettarız. Biz cömertçe Sox2 kodlama dizisi ile bize sağlamak için Dr Marius WERNIG (Stanford Üniversitesi) teşekkür ederim. Biz de virüs üretimi için Dr Alexandra Lepier için çok müteşekkiriz. Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft (4182/2-2 BE) ve BMBF (01GN1009A) BB, ve Bavyera Bilimler Devlet Bakanlığı, Araştırma ve MK ve BBCs için Sanatları uluslu SYSTHER-fon alınan hibe ile desteklenmiştir INREMOS Sanal Enstitüsü (Eğitim ve Araştırma Alman ve Sloven Federal Bakanlıklar) ve DFG (SFB 824).

Materials

anti-CD140b-PE BD Biosciences 558821 use 1:100
anti-CD146-FITC AbD Serotec MCA2141FT use 1:100
anti-CD13-FITC AbD Serotec MVA1270A488T use 1:100
anti-CD34-APC BD Biosciences 560940 use 1:100
anti-PDGFRβ Cell Signaling 3169S use 1:200
anti-CD146 Abcam Ab75769 use 1:400
anti-NG2 Millipore AB5320 use 1:400
anti-SMA Sigma-Aldrich A2547 use 1:400
anti-βIII-tubulin Sigma-Aldrich T8660 use 1:400
anti-MAP2 Sigma-Aldrich M4403 use 1:200
anti-GFAP Sigma-Aldrich G3893 use 1:600
anti-GFP Aves Labs GFP 10-20 use 1:1000
anti-RFP Chromotek 5F8 use 1:500
anti-S100β Sigma-Aldrich S2532 use 1:300
anti-NeuN Millipore MAB377 use 1:200
anti-GABA Sigma-Aldrich A2052 use 1:500
anti-Calretinin Millipore AB5054 use 1:500
anti-vGluT1 SYnaptic SYstems 135511 use 1:1000
Rat IgG1 isotype control FITC AbD Serotec 11-4301-81 use 1:100
Rat IgG1 isotype control PE AbD Serotec 12-4301-81 use 1:100
Rat IgG1 isotype control APC AbD Serotec 17-4301-81 use 1:100
TrypLE Invitrogen 12605-010
DMEM, high glucose, GlutaMAX Invitrogen 61965
B27 serum-free supplement Invitrogen 17504044
fetal calf serum Invitrogen 10106-169 perform heat inactivation by incubation at 56 °C for 30 min
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140122
HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) Invitrogen 24020-091
Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS, 1×; Invitrogen, cat. no. 14190) Invitrogen 14190
HEPES  Sigma-Aldrich H3375
Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) Sigma-Aldrich P0899
PFA (paraformaldehyde) Sigma-Aldrich P1648
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A9418
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284
DAPI (4′,6-Diamidin-2-phenylindole) dilactate Sigma-Aldrich 042M4005
Aqua-Poly/Mount Polysciences 18606-20
Polypropylene round-bottom tubes  BD Biosciences 352063
Polystyrene round-bottom tubes with cell-strainer cap  BD Biosciences 352235
24-well plates Orange Scientific 5530305
75 cm2 culture flasks Greiner Bio-One 658175
25 cm2 culture flasks Greiner Bio-One 690175
Disposable pipettes 10 ml Sarstedt #########
Glass Pasteur pipettes (150 mm) Fisherbrand FB50251
Glass coverslips 12 mm diameter Menzel CB00120RA1
Surgical disposable scalpels  B. Braun 5518083
Tissue culture dishes  Greiner Bio-One 633180
Conical tubes 15ml BD Biosciences 352095
Laminar flow hood
Centrifuge and swing-out rotor with adapters for 15 ml and 50 ml tubes Hettich Lab Technology 1406
Flow cytometry cell sorter: FACSAria l with FACSDiva software  BD Biosciences
Humified cell culture incubator Eppendorf Galaxy 170R
Wather bath at 37 °C
FACSFlow sheath fluid  BD Biosciences 342003
Epifluorescence microscope BX61 Olympus
Confocal microscope LSM710 Zeiss

References

  1. Caiazzo, M., et al. Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. Nature. 476, 224-227 (2011).
  2. Kim, J., et al. Functional integration of dopaminergic neurons directly converted from mouse fibroblasts. Cell stem cell. 9, 413-419 (2011).
  3. Duan, B., et al. Interactions between water deficit, ABA, and provenances in Picea asperata. Journal of experimental botany. 58, 3025-3036 (2007).
  4. Heinrich, C., et al. Directing astroglia from the cerebral cortex into subtype specific functional neurons. PLoS Biol. 8, (2010).
  5. Heinrich, C., et al. Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex. Nat Protoc. 6, 214-228 (2011).
  6. Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells. J Vis Exp. , (2007).
  7. Karow, M., et al. Reprogramming of pericyte-derived cells of the adult human brain into induced neuronal cells. Cell stem cell. 11, 471-476 (2012).
  8. Ortega, F., et al. Using an adherent cell culture of the mouse subependymal zone to study the behavior of adult neural stem cells on a single-cell level. Nat Protoc. 6, 1847-1859 (2011).
  9. Ladewig, J., et al. Small molecules enable highly efficient neuronal conversion of human fibroblasts. Nat Methods. 9, 575-578 (2012).
  10. Espuny-Camacho, I., et al. Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo. Neuron. 77, 440-456 (2013).
  11. Davila, J., Chanda, S., Ang, C. E., Sudhof, T. C., Wernig, M. Acute reduction in oxygen tension enhances the induction of neurons from human fibroblasts. J Neurosci Methods. 216, 104-109 (2013).
  12. Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463, 1035-1041 (2010).
  13. Pfisterer, U., et al. Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 10343-10348 (2011).
  14. Lu, J., et al. Generation of Integration-free and Region-Specific Neural Progenitors from Primate Fibroblasts. Cell Rep. 3, 1580-1591 (2013).
  15. Yang, N., Ng, Y. H., Pang, Z. P., Sudhof, T. C., Wernig, M. Induced neuronal cells: how to make and define a neuron. Cell Stem Cell. 9, 517-525 (2011).
  16. Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476, 220-223 (2011).
  17. Yoo, A. S., et al. MicroRNA-mediated conversion of human fibroblasts to neurons. Nature. 476, 228-231 (2011).
  18. Son, E. Y., et al. Conversion of mouse and human fibroblasts into functional spinal motor neurons. Cell Stem Cell. 9, 205-218 (2011).
  19. Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 2527-2532 (2012).
  20. Thier, M., et al. Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells. Cell Stem Cell. 10, 473-479 (2012).
  21. Yang, N., et al. Generation of oligodendroglial cells by direct lineage conversion. Nat Biotechnol. 31, 434-439 (2013).
  22. Najm, F. J., et al. Transcription factor-mediated reprogramming of fibroblasts to expandable, myelinogenic oligodendrocyte progenitor cells. Nat Biotechnol. 31, 426-433 (2013).
check_url/fr/51433?article_type=t

Play Video

Citer Cet Article
Karow, M., Schichor, C., Beckervordersandforth, R., Berninger, B. Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons. J. Vis. Exp. (87), e51433, doi:10.3791/51433 (2014).

View Video