MALDI-massespektrometrisk Imaging for etterforskningen av metabolitter i<em> Medicago truncatula</em> Root Knuter
Summary
Massespektrometrisk imaging (MSI) er et kraftig verktøy som kan brukes til å oppdage og identifisere ulike kjemiske stoffer i intakt vev, bevare forbindelsene i sine opprinnelige omgivelser, noe som kan gi ny innsikt i biologiske prosesser. Heri en MSI metode utviklet for analyse av små molekyler er beskrevet.
Abstract
De teknikker som brukes for å undersøke små molekyler, slik som farmasøytiske medikamenter eller endogene metabolitter, benytter vevsekstrakter som krever homogenisering av vev av interesse som kan forårsake forandringer i de metabolske baner som studeres en. Massespektrometrisk imaging (MSI) er et kraftig analytisk verktøy som kan gi romlig informasjon av analytter innen intakte skiver av biologiske vevsprøver 1-5. Denne teknikken er blitt brukt i stor utstrekning for å studere forskjellige typer av forbindelser, inkludert proteiner, peptider, lipider, og små molekyler slik som endogene metabolitter. Med matrise-assistert laser desorpsjon / ionisering (MALDI)-MSI, kan romlige fordelinger av flere metabolitter være samtidig oppdaget. Heri, er en metode utviklet spesielt for å gjennomføre vilkårlige metabolomics MSI eksperimenter på legume røtter og rot knuter presenteres som kunne avsløre innsikt i de biologiske prosessene som foregår. DenMetoden som presenteres her viser en typisk MSI arbeidsflyt, fra prøvepreparering for bildeopptak, og fokuserer på matrisen påføringstrinnet, noe som viser flere matriks påføringsteknikker som er nyttige for detektering av små molekyler. Når MS-bilder genereres, er analysen og identifisering av metabolitter av interesse diskutert og demonstrert. Standarden arbeidsflyt presenteres her kan enkelt endres for ulike vevstyper, molekylære arter, og instrumentering.
Introduction
Den voksende feltet av metabolomics har mange viktige biologiske bruksområder, inkludert biomarkører, tyde metabolske veier i planter og andre biologiske systemer, og toksikologi profilering 4,6-10. En stor teknisk utfordring når en skal studere biologiske systemer er å studere metabolomic trasé uten å forstyrre dem 11. MALDI-MSI gir mulighet for direkte analyse av intakte vev som gjør at sensitiv deteksjon av analytter i enkeltorganer 12,13 og til og med enkeltceller 14,15.
Prøveopparbeidelse er et viktig skritt i å produsere reproduserbare og pålitelige massespektraldata bilder. Kvaliteten av bildene er meget avhengig av faktorer som vev innstøping medium, snittykkelse, MALDI matrise, og matrisen påføringsteknikk. For avbildningsapplikasjoner, er ideelt tykkelse delen av bredden av en celle (8 til 20 mikrometer, avhengig av prøvetype). MALDI krever deponering av en organisk, crystalline matrise forbindelsen, vanligvis en svak syre, på prøven for å bistå analytt-ablasjon og ionisering. seksten forskjellige matriser gi forskjellige signalintensitet, interfererende ioner, samt ionisering av effektiviteten av forskjellige klasser av forbindelser.
Matrisen applikasjon teknikk spiller også en rolle i kvaliteten på massespektraldata bilder og forskjellige teknikker er egnet for forskjellige klasser av analytter. Tre matrise påføringsmetoder er presentert i denne protokollen: airbrush, automatisk sprøyta, og sublimering. Airbrush matrise søknaden er mye brukt i MALDI bildebehandling. Fordelen med Spraymaling matrise søknad, er at den er relativt rask og enkel. Imidlertid avhenger kvaliteten på airbrush matrise bruksområdet betraktelig på dyktighet av brukeren og har en tendens til å være mindre reproduserbar og forårsake spredning av analytter, spesielt små molekyler 17. Automatiske sprøyter systemer har lignende mekanikere til airbrush matrise program, men have er utviklet for å fjerne variabilitet sett med manuell airbrush påføring, noe som gjør spray mer reproduserbar. Denne metoden kan noen ganger være mer tidkrevende enn tradisjonell airbrush matrise søknad. Både manuell airbrush og automatiske sprøyter systemer er løsemiddelbaserte matrise påføringsmetoder. Sublimering er en tørr matrise påføringsteknikk som blir mer og mer populært for masse spektral avbildning av metabolitter og små molekyler fordi det reduserer analytt diffusjon, men mangler det løsemiddel nødvendig å trekke ut og observere høyere masse forbindelser 18.
Trygge identifikasjon av metabolitter krever vanligvis nøyaktige masse målinger for å oppnå antatte identifikasjoner fulgt av tandem masse (MS / MS) eksperimenter for validering, med MS / MS spektra blir sammenlignet med standarder, litteratur eller teoretisk spektra. I denne protokoll høy oppløsning (masse oppløsningsevne på 60.000 ved m / z 400), væskekromatografi (LC)-MS er forbundet med MALDI-MSI å oppnå både romlig informasjon og trygg identifisering av endogene metabolitter, ved hjelp Medicago truncatula røtter og rot knuter som det biologiske system. MS / MS eksperimenter kan utføres direkte på vev med MALDI-MSI eller på vevsekstrakter med LC-MS og brukes til validering av metabolitten identifikasjoner.
Denne protokollen gir en enkel metode for å kartlegge endogene metabolitter i M. truncatula, som kan tilpasses og brukes til MSI av små molekyler i forskjellige typer vev og biologiske systemer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Som omtalt ovenfor, er prøvepreparering det mest kritiske trinn i MSI arbeidsflyten. Inkludering vevet ujevnt vil føre til snitting å være vanskelig eller ikke mulig i noen tilfeller. Størrelse Seksjonen og tilstrekkelig ekvilibreringstid er avgjørende for å opprettholde vevet integritet og å unngå folding og tårer. Valg av matrisen og påføringsteknikk vil spille en rolle i å bestemme typer av analytter som skal påvises, den romlige oppløsning, og reproduserbarhet av resultatene. Ved hjelp av en kombinasj…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å takke dr. Jean-Michel ane ved Institutt for agronomi ved UW-Madison for å gi Medicago truncatula prøver. Dette arbeidet ble støttet delvis av midler fra National Science Foundation (NSF) stipend CHE-0957784, University of Wisconsin Graduate School og Wisconsin Alumni Research Foundation (WARF) og Romnes Fakultet stipendprogram (til LL). EG erkjenner en NSF Graduate Research Fellowship (DGE-1256259).
Materials
| Gelatin | Difco | 214340 | heat to dissolve |
| Cryostat- HM 550 | Thermo Scientific | 956564A | |
| indium tin oxide (ITO)-coated glass slides | Delta Technologies | CB-90IN-S107 | 25-75-0.8 mm (width-length-thickness) |
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix | ICN Biomedicals | PI90033 | |
| Airbrush | Paasche Airbrush Company | TG-100D | coupled with 75 ml steel container |
| Automatic matrix sprayer system- TM-Sprayer | HTX Technologies, LLC | HTX.TMSP.H021-U | Specific start-up and shut-down instructions will be given when the instrument is installed |
| Sublimation apparatus | Chemglass Life Science | CG-3038-01 | |
| Vaccum pump- Alcatel 2008 A | Ideal Vacuum Products | P10976 | Ultimate Pressure = 1×10-4 Torr |
| ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF | Bruker Daltonics | 276601 | |
| FlexImaging | Bruker Daltonics | 269841 | One example of "vender specific software" |
| MALDI LTQ Orbitrap | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMASZ | High resolution MALDI instrument for accurate mass measurements |
| Q Exactive | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMAZR | High resolution LC-MS instrument for accurate mass measurements |
References
- Seeley, E. H., Schwamborn, K., Caprioli, R. M. Imaging of Intact Tissue Sections: Moving beyond the Microscope. J. Biol. Chem. 286, 25459-25466 (2011).
- van Hove, E. R. A., Smith, D. F., Heeren, R. M. A. A concise review of mass spectrometry imaging. J. Chromatogr. A. 1217, 3946-3954 (2010).
- Lietz, C. B., Gemperline, E., Li, L. Qualitative and quantitative mass spectrometry imaging of drugs and metabolites. Adv. Drug Deliv. Rev. 65, 1074-1085 (2013).
- Ye, H., et al. MALDI mass spectrometry-assisted molecular imaging of metabolites during nitrogen fixation in the Medicago truncatula-Sinorhizobium meliloti symbiosis. Plant J. 75, 130-145 (2013).
- Ye, H., Gemperline, E., Li, L. A vision for better health: mass spectrometry imaging for clinical diagnostics. Clin. Chim. Acta. 420, 11-22 (2013).
- Wei, R. Metabolomics and Its Practical Value in Pharmaceutical Industry. Curr. Drug Metab. 12, 345-358 (2011).
- Kobayashi, T., et al. A Novel Serum Metabolomics-Based Diagnostic Approach to Pancreatic Cancer. Cancer Epidem. Biomar. 22, 571-579 (2013).
- West, P. R., Weir, A. M., Smith, A. M., Donley, E. L. R., Cezar, G. G. Predicting human developmental toxicity of pharmaceuticals using human embryonic stem cells and metabolomics. Toxicol. Appl. Pharm. 247, 18-27 (2010).
- Spegel, P., et al. Time-resolved metabolomics analysis of beta-cells implicates the pentose phosphate pathway in the control of insulin release. Biochem. J. 450, 595-605 (2013).
- Pendyala, G., Want, E. J., Webb, W., Siuzdak, G., Fox, H. S. Biomarkers for neuroAIDS: The widening scope of metabolomics. J. Neuroimmune. Pharm. 2, 72-80 (2007).
- Prell, J., Poole, P. Metabolic changes of rhizobia in legume nodules. Trends Microbiol. 14, 161-168 (2006).
- Kutz, K. K., Schmidt, J. J., Li, L. J. In situ tissue analysis of neuropeptides by MALDI FTMS in-cell accumulation. Anal. Chem. 76, 5630-5640 (1021).
- Stemmler, E. A., et al. High-mass-resolution direct-tissue MALDI-FTMS reveals broad conservation of three neuropeptides (APSGFLGMRamide, GYRKPPFNGSIFamide and pQDLDHVFLRFamide) across members of seven decapod crustaean infraorders. Peptides. 28, 2104-2115 (2007).
- Rubakhin, S. S., Churchill, J. D., Greenough, W. T., Sweedler, J. V. Profiling signaling peptides in single mammalian cells using mass spectrometry. Anal. Chem. 78, 7267-7272 (1021).
- Neupert, S., Predel, R. Mass spectrometric analysis of single identified neurons of an insect. Biochem. Bioph. Res. Co. 327, 640-645 (2005).
- Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular imaging of biological samples: localization of peptides and proteins using. MALDI-TOF MS. Anal. Chem. 69, 4751-4760 (1997).
- Baluya, D. L., Garrett, T. J., Yost, R. A. Automated MALDI matrix deposition method with inkjet printing for imaging mass spectrometry. Anal. Chem. 79, 6862-6867 (2007).
- Hankin, J. A., Barkley, R. M., Murphy, R. C. Sublimation as a method of matrix application for mass spectrometric imaging. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 18, 1646-1652 (2007).
- Robichaud, G., Garrard, K. P., Barry, J. A., Muddiman, D. C. MSiReader: an open-source interface to view and analyze high resolving power MS imaging files on Matlab platform. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24, 718-721 (2013).
- Northen, T. R., et al. Clathrate nanostructures for mass spectrometry. Nature. 449, (2007).
- Shrivas, K., Hayasaka, T., Sugiura, Y., Setou, M. Method for simultaneous imaging of endogenous low molecular weight metabolites in mouse brain using TiO2 nanoparticles in nanoparticle-assisted laser desorption/ionization-imaging mass spectrometry. Anal. Chem. 83, 7283-7289 (2011).
- Thomas, A., Charbonneau, J. L., Fournaise, E., Chaurand, P. Sublimation of new matrix candidates for high spatial resolution imaging mass spectrometry of lipids: enhanced information in both positive and negative polarities after 1,5-diaminonapthalene deposition. Anal. Chem. 84, 2048-2054 (2012).
- Chen, S., et al. 2,3,4,5-Tetrakis(3′,4′-dihydroxylphenyl)thiophene: a new matrix for the selective analysis of low molecular weight amines and direct determination of creatinine in urine by MALDI-TOF MS. Anal. Chem. 84, 10291-10297 (2012).
- Shroff, R., Rulisek, L., Doubsky, J., Svatos, A. Acid-base-driven matrix-assisted mass spectrometry for targeted metabolomics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 10092-10096 (2009).
- Shroff, R., Svatos, A. Proton sponge: a novel and versatile MALDI matrix for the analysis of metabolites using mass spectrometry. Anal. Chem. 81, 7954-7959 (2009).
- Shimma, S., Setou, M. Mass Microscopy to Reveal Distinct Localization of Heme B (m/z 616) in Colon Cancer Liver Metastasis. J. Mass Spectrom. Soc. Jpn. 55, 145-148 (2007).
- Paschke, C., et al. Mirion-A Software Package for Automatic Processing of Mass Spectrometric Images. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24, 1296-1306 (2013).
- Parry, R. M., et al. omniSpect: an open MATLAB-based tool for visualization and analysis of matrix-assisted laser desorption/ionization and desorption electrospray ionization mass spectrometry images. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24, 646-649 (2013).
