Gransker Protein-protein interaksjoner i levende celler ved hjelp Bioluminesens Resonance Energy Transfer

Summary

Interaksjoner mellom proteiner er grunnleggende for alle cellulære prosesser. Ved hjelp Bioluminescence Resonance Energy Transfer, kan interaksjonen mellom et par av proteiner bli overvåket i levende celler og i sanntid. Videre kan effekten av potensielt sykdomsfremkallende mutasjoner vurderes.

Abstract

Analyser basert på Bioluminesens Resonance Energy Transfer (BRET) gi en sensitiv og pålitelig metode for å overvåke protein-protein interaksjoner i levende celler. Bret er den ikke-strålingen overføring av energi fra en donor luciferase enzym til en "akseptor" fluorescerende protein. I den mest vanlige konfigurasjonen av denne analyse, er den donor Renilla reniformis luciferase og akseptor er Gul Fluorescent Protein (YFP). På grunn av at effektiviteten av energioverføringen er sterkt avstandsavhengig, observasjon av Bret fenomen krever at donor-og akseptor være i umiddelbar nærhet. For å teste for en interaksjon mellom to proteiner av interesse i dyrkede pattedyrceller, er et protein uttrykt som en fusjon med luciferase og andre som en fusjon med YFP. En interaksjon mellom de to proteiner av interesse kan bringe donor og akseptor tilstrekkelig nær for energioverføring å oppstå. Sammenlignet med andre teknikker for å undersøke protein-protein imoter, den BRET analysen er sensitiv, krever lite hands-on tid og få reagenser, og er i stand til å oppdage interaksjoner som er svak, forbigående, eller avhengig av biokjemiske miljøet funnet innenfor en levende celle. Det er derfor en ideell metode for å bekrefte putative interaksjoner slått av gjær to-hybrid eller massespektrometri proteomikk studier, og i tillegg er det vel-egnet for kartlegging samspill regioner, der effekten av post-translasjonelle modifikasjoner av protein-protein-interaksjoner og evaluere virkningen av mutasjoner identifisert i pasientens DNA.

Introduction

Både klassisk hydraulikk og neste generasjons sekvenseringsanalyser av menneskelige lidelser er avslørende den kliniske relevansen av proteiner som er involvert i en rekke biologiske mekanismer. Det er ofte slik at det forut for deres identifikasjon i slike undersøkelser, har det vært liten eller ingen undersøkelse av den biologiske rollen til disse proteiner. En fruktbar vei å begynne å utforske den biologiske funksjonen til et protein av interesse er å identifisere hvilke andre proteiner den samhandler med i sin fysiologisk sammenheng. Karakteriserer molekylære nettverk på denne måten gir innsikt i de biologiske mekanismer ligger til grunn for menneskelig fenotype.

Den mest brukte storskala screening tilnærminger for å identifisere kandidatinteraksjonspartnere for proteiner av interesse er gjær to-hybrid screening ^en og massespektrometri-baserte proteomikk ^to. Disse metodene kan være svært vellykket i å foreslå potensielle samspill proteiner, men are utsatt for falske positive resultater. Derfor, bekreftelse på en interaksjon identifisert av gjær to-hybrid eller massespektrometri screening krever validering av interaksjonen ved hjelp av en andre teknikk. Vanligvis en co-immunoprecipitation eller trekk-ned-analysen brukes til dette formålet ^tre. En ulempe ved bruk av slike teknikker for validering er kravet til cellelyse, som ødelegger de intracellulære betingelsene som kan være nødvendig for å opprettholde visse protein interaksjoner. En andre ulempe er at svake eller flyktige protein interaksjoner kan bli forstyrret under vasketrinnene. Videre har disse assays krever betydelig praktisk tid, er begrenset i antall prøver som kan behandles samtidig, og krever ofte tidkrevende optimalisering av reagenser og protokoller.

For å overvinne noen av problemene i forbindelse med ko-immunoprecipitation eksperimenter, har flere bestemmelser blitt utviklet basert på fluorescerende og bioluminescent proteiner som kan anvendes i levende celler. Den første av disse analysene ble basert på fluorescens (eller Förster) Resonance Energy Transfer (FRET), den ikke-strålingsenergioverføring mellom to fluorescerende proteiner med overlappende emisjon og eksitasjon spektra ^4.. Effektiviteten av energioverføringen er sterkt avstandsavhengig, og derfor observasjon av FRET fenomen krever at donor-og akseptor fluoroforer være i umiddelbar nærhet. For å teste for en interaksjon mellom to proteiner av interesse, er et protein uttrykt som en fusjon med donor-fluorofor (vanligvis cyan fluorescerende protein, CFP), og den andre som en fusjon med akseptor fluorofor (ofte gul fluorescerende protein; YFP). En interaksjon mellom de to proteiner av interesse kan bringe giver-og akseptor fluoroforer tilstrekkelig tett for energioverføring å oppstå, noe som vil resultere i en målbar økning i utslippet av lys fra YFP akseptor i forhold til CFP donor. FRET har vært vellykket i å oppdage protein-protein interaksjoner i levende celler ^fire. Den største ulempen med å bruke FRET for detektering protein-protein-interaksjoner er kravet for ekstern belysning for eksitering av donor-fluoroforen. Eksterne belysnings resulterer i høy bakgrunn i utslipps signal, uønsket magnetisering av akseptor, og fotobleking av både donor-og akseptor fluoroforer. Disse effektene følsomheten av analysen for å påvise protein-protein interaksjoner redusere.

En modifikasjon av FRET assay som overvinner problemet med høy bakgrunn mot ekstern belysning er Bioluminescence Resonance Energy Transfer (Bret) assay ^5,6. I Bret system donor fluoroforen er erstattet av et luciferase-enzymet. Således energien for magnetisering av akseptor fluoroforen er generert i systemet ved oksidasjon av et luciferase-substrat, slik at ekstern belysning unødvendig. I den mestvanlig konfigurasjon av denne analyse, er den donor Renilla reniformis luciferase og akseptor er YFP (for en diskusjon av alternative donor-og akseptor proteiner se Pfleger et al. ^5). Følgelig, i dette system, er et protein av interesse fusjonert til luciferase og et potensielt veksel protein til YFP, eller vice versa. Den BRET analysen krever tillegg av coelenterazine som substrat for luciferase. Fordi coelenterazine er cellepermeable, er det mulig å utføre BRET assays i levende celler. Imidlertid er innfødt coelenterazine ustabilt i vandig løsning, og den enzym uavhengig nedbrytning av coelenterazine både reduserer konsentrasjonen av substratet er tilgjengelig for analyse og genererer autoluminescence, noe som reduserer følsomheten av målinger av luciferase-aktivitet. Bruken av Bret i levende celler er blitt muliggjort ved utviklingen av beskyttede coelenterazines, som er stabile i vandig oppløsning, men spaltes av esterase cytosoliskes etter diffusjon gjennom cellemembranen for å generere aktiv coelenterazine inne i cellen ^7..

Etter tillegg av underlaget til celler uttrykker luciferase-og YFP-fusjonsproteiner, er energioverføring som følge av protein-protein interaksjoner kvantifisert ved å overvåke utslipp fra luciferase og YFP. Ettersom protein interaksjoner kan overvåkes direkte i levende celler i multi-brønnplater, utgjør Bret-analysen er en enkel og skalerbar fremgangsmåte for validering av putative interaksjoner som er kostnads-og tidssparende.

I tillegg til å validere putative interactors identifisert i proteomic screening-undersøkelser, kan det Bret-systemet også anvendes til å teste kandidatinteractors som oppstår ved tidligere biokjemiske og strukturelle studier av proteinet av interesse. Når tilstedeværelsen av et protein-protein interaksjon har blitt etablert (enten ved å bruke Bret assay, eller ved andre teknikker), er det potensial for Bret assay for å være employed ytterligere å karakterisere samspillet. For eksempel kan de samvirkende områder kartlegges ved å generere avkortede versjoner av proteinene, og involvering av spesifikke rester i interaksjon kan bli demonstrert ved å skape punktmutasjoner. Videre kan den regulerende virkning av posttranslational modifikasjoner eller små molekyler (f.eks narkotika eller ligander) på protein-protein interaksjoner undersøkes ^8-10.

Den BRET analysen har også et stort potensial for å undersøke identifiserte mutasjoner i pasientens DNA. I tilfeller der en utløsende rolle for en mutasjon er etablert, å studere effekten av mutasjonen på protein-protein interaksjoner med BRET kan avsløre mer om den molekylære etiologi av fenotype ^11. Siden ankomsten av neste generasjons sekvensering metoder, er det stadig mer vanlig at flere potensielt skadelige mutasjoner å bli identifisert i løpet av et individ, i så fall er det uklart hvilke er relevante til fenotype ^12. I denne situasjonen BRET analysen kan være verdifulle i å vurdere effekten av mutasjoner på protein funksjon og dermed sin relevans til uorden.

Protocol

En. Opprettelse av plasmider Subklon av cDNA for hver proteinet av interesse inn i både pLuc og pYFP vektorer, ved bruk av standard molekylærbiologiske teknikker (se figur 1). For detaljerte protokoller se Green et al 13. Sequence alle konstruerer å verifisere at proteiner av interesse er i ramme med Luc / YFP sekvens uten mellomliggende stoppkodoner. Utfør funksjonelle analyser etter ønske for å få bekreftet at fusjonsproteiner beholde biologisk…

Representative Results

Prinsippet for Bret-analysen er vist i figur 2.. Analysen oppsett brukes gjennom eksperimentene er presentert her, er vist i figur 3.. Påvisning av en sterk Bret signal fra celler transfektert med luciferase-YFP fusion protein bekreftet at energioverføring var observerbar i denne eksperimentelle oppsettet (figur 4). Vår forskning fokuserer på rollen til FOXP familien av transkripsjons repressors i hjernens utvikling. Heterozygote mutasjo…

Discussion

Utformingen av fusion protein ekspresjonskonstruksjoner er et avgjørende skritt i å sette opp BRET analysen. I forsøkene er presentert her, ble proteinene av interesse fusjonert til C-terminalen av luciferase eller YFP. Det er også mulig, og kan være nødvendig, å smelte proteiner til N-terminus av luciferase / YFP. For noen proteiner, kan fusions bare bli akseptert på enten den N-eller C-terminus for å unngå forstyrrelse av proteinstruktur og funksjon. Videre, for transmembrane proteiner hvor N-og C-termini bo…

Materials

Nanodrop 8000	Nanodrop		Any spectrophotometer capable of reading absorbances at 260 nm will be suitable. Determining the molecular mass of the plasmid is crucial for calculating DNA quantities to be used in transfection mixes.
96 microwell plates, flat bottom, white	Greiner Bio One	655098	White plates reduce the crosstalk between wells and maximize the sensitivity of luminescence detection. Clear-bottomed wells allow monitoring of cell density. Plates must be suitable for cell culture. If using a top-reading luminometer the plate lid should be taken off.
Infinite F200Pro plate reader with control software	TECAN		Use the 'Blue 1' and 'Green 1' filters for luminescence measurement and the filter sets and dichoic mirror for GFP for fluorescence measurement. Any top-reading plate reader with capability of measuring dual-color luminescence and fluorescence is suitable.
pLuc, pYFP, positive control plasmid	N/A	N/A	Plasmids available from the authors upon request.
pGEM-3Zf(+)	Promega	P2271	Filler plasmid for equilization of DNA mass in transfection mixes. Any plasmid lacking a eukaryotic promoter would be suitable.
HEK293 cells	ECACC	85120602	Other cell lines that transfect with reasonable efficiency may be suitable.
DMEM, high glucose, with phenol red	Gibco	41966	This is the medium used for culturing HEK293 cells. Warm in 37 °C waterbath before use. If using a different cell line, replace the growth medium described here with cell-line specific medium.
DMEM, high glucose, no phenol red (substrate dilution medium)	Gibco	21063	This is the substrate dilution medium used for dilution of the luciferase substrate (EnduRen) as it does not contain phenol red, which reduces the sensitivity of the assay. Contains HEPES to maintain correct pH during luminescence measurements while cells are out of the CO2 incubator. Warm in 37 °C waterbath before use.
OptiMEM	Gibco	31985	OptiMEM is used for dilution of GeneJuice transfection reagent. Other serum-free media would also be suitable. Warm to room temperature before use.
Fetal bovine serum	Gibco	10270	For supplementation of cell culture media at a concentration of 10% v/v.
GeneJuice transfection reagent	Novagen	70967	If using a cell line other than HEK293, it may be necessary to adjust the ratio of Genejuice transfection reagent to DNA in the transfection mixes. Other transfection reagents may be used. If using an alternative transfection reagent, it may be necessary to optimize the amount of DNA used in the transfection mixes based on manufacturer's instructions.
DMSO	Sigma	D2650	Use sterile DMSO that is suitable for tissue culture.
EnduRen live-cell substrate	Promega	E6481	Reconstitute EnduRen at 34 mg/ml in DMSO. Upon dilution of EnduRen in culture medium a precipitate may form. This will not interfere with the assay. Store reconstituted EnduRen at -20 °C, and avoid multiple freeze-thaw cycles. Ensure that reconstituted EnduRen is completely thawed before diluting it in culture medium.