Een eenvoudige en snelle protocol voor het meten van neutrale lipiden in algencellen met behulp van fluorescentie
Summary
Een eenvoudig protocol om de neutrale vetgehalte van algen cellen te bepalen met behulp van een Nile Red kleuring procedure wordt beschreven. Deze tijdbesparende techniek biedt een alternatief voor traditionele-gravimetrische basis lipide kwantificering protocollen. Het is ontworpen voor de specifieke toepassing van controle bioproces prestaties.
Abstract
Algen worden beschouwd als uitstekende kandidaten voor hernieuwbare energiebronnen, door de natuurlijke lipiden opslag mogelijkheden. Krachtige systemen van algen fermentatieprocessen en screening op nieuwe olierijke stammen vereist een snelle en betrouwbare protocol voor de bepaling van intracellulaire lipidegehalte. Huidige praktijken grotendeels aangewezen op gravimetrische methoden om het oliegehalte te bepalen, technieken ontwikkeld decennia geleden die tijdrovend zijn en grote steekproef volumes vereisen. In dit document, Nile Red, een fluorescerende kleurstof die wordt gebruikt om de aanwezigheid van lipide organen in tal van soorten organismen identificeren, wordt opgenomen in een eenvoudige, snelle en betrouwbare protocol voor de neutrale lipiden van Auxenochlorella protothecoides, een groene alg. De methode maakt gebruik van ethanol, een relatief mild oplosmiddel, aan de celmembraan voor kleuring en 96 goed micro-plaat monstercapaciteit in fluorescentie-intensiteit metingen toenemen doorlaatbaar. Het ontwerp ised met de specifieke toepassing van het toezicht bioproces prestaties. Eerder gedroogde monsters en levende monsters van een groeiende kweek kan worden gebruikt in de test.
Introduction
Vanwege hun vermogen om lipiden organen opslaan onder bepaalde stresscondities algen hebben veel aandacht in de afgelopen jaren als potentiële duurzame brandstofbron 1,2. Neutrale lipiden kan goed zijn voor meer dan 60% van de cel drooggewicht onder geschikte groeiomstandigheden 3. Toch is de industrie niet over een eenvoudige, schone, snelle en betrouwbare gestandaardiseerd protocol om vetgehalte van algen cellen te kwantificeren om goed te monitoren bioproces prestaties, culturen te analyseren, en het scherm voor nieuwe stammen.
De Bligh-Dyer gravimetrische methode ontwikkelde zo'n 50 jaar geleden blijft een van de meest voorkomende technieken die vandaag de dag 4,5 gebruikt. Hoewel deze procedure is eenvoudig, betrouwbaar en eenvoudig uit te voeren, is tijdrovend, vereist grote monstervolumes, en maakt gebruik van toxische oplosmiddelen. Het is niet praktisch voor het analyseren van vele samples van een fermentatie run of screening voor nieuwe olie-rijke stammen. Andere methoden bEEN-ontwikkeld, maar meestal vereisen geavanceerde apparatuur en zijn niet gestandaardiseerd 6.
Een alternatief dat heeft vergaard een grote belangstelling is de Nijl Rode vlek. Nile Red, een kleurstof die fluoresceert bij voorkeur in niet-polaire omgevingen is gebruikt om lipide organen in verschillende organismen, waaronder nematoden 7, gist 8, 9 bacteriën en algen 10-19 identificeren of kwantificeren. Initial technieken met Nile Red waren meestal kwalitatieve of semi-kwantitatieve, het combineren van de vlek met single-cuvette spectrofotometrie of flowcytometrie. Bovendien zijn sommige soorten algen zoals groene algen dikke celputjes die meestal ondoorlaatbaar kleurstof, die het bereik van de techniek 10 beperkt.
Recente verbeteringen aan de Nijl Rode kleuringsmethode gemeld dat de aanvankelijke tekortkomingen van het protocol 10,11 omzeilen. Kleuring van de cellen in de aanwezigheid van een carrier oplosmiddel zoals DMSO 10 of ethanol 10,11 linearizes de relatie tussen oliegehalte en absorptie, waardoor betrouwbare kwantitatieve metingen. Het oplosmiddel helpt permeabilize het celmembraan, zodat de Nijl Rode moleculen kan passeren. Daarnaast is het opnemen van een spectrofotometer met micro-plaat leesmogelijkheid zorgt voor een hoge doorvoersnelheid protocollen geschikt voor kwantitatieve analyse.
In dit artikel gedetailleerd een eenvoudige werkwijze voor het meten oliegehalte van algen cellen door kleuring culturen Nijl Rood in aanwezigheid van ethanol, een mild oplosmiddel. Om zo goed mogelijk rekening te houden achtergrondruis in de metingen wordt een standaardcurve correleren fluorescentie intensiteit oliegehalte ontwikkeld met algen bekende oliesamenstelling. De methode is een bewerking van eerder gepubliceerde protocollen 10,11. Door een 96-putjes spectrofotometer, men in staat om dezelfde hoeveelheid te analyseren in een uur that zou dagen duren om te controleren door gravimetrische methoden. Bovendien, door het kalibreren met behulp van representatieve monsters van de gewenste algensoorten deze methode levert relatief nauwkeurige metingen die direct interpreteerbaar. Er bestaan vele protocollen, waarin de methoden van kleuring algen met Nile Red geoptimaliseerd voor verschillende stammen en toepassingen; het protocol hier gepresenteerde werd oorspronkelijk ontwikkeld door de la Hoz Siegler et al.. 11 voor Auxenochlorella protothecoides, Chlorella vulgaris, Scenedesmus dimorphus en Scenedesmus obliquus, hoewel het waarschijnlijk is geschikt voor veel meer soorten en klassen. Het is ontworpen met de specifieke toepassing van het toezicht bioprocess prestaties en het werkt even goed voor eerder gedroogde monsters en natte monsters van een groeiende cultuur.
Protocol
Representative Results
Discussion
De algen in de standaardcurve moet dezelfde soort gekweekt onder dezelfde experimentele omstandigheden als die gemeten. Significante veranderingen in de samenstelling van het materiaal, teelttechniek en kleuringsprotocol kan invloed hebben op de intensiteit van de fluorescentie lezen. Hexaanextractie (in de punten 1 en 2 beschreven) werd gebruikt om de neutrale vetgehalte van de monsters die in de standaard curve te bepalen. Voor nauwkeurige fluorescentie-intensiteit metingen moeten alle monsters worden geanalyseerd op …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada bedanken voor het verlenen van financiële steun voor dit project.
Materials
| Dry Weight | |||
| 25 ml disposable pipettes | Fisher | 13-676-10K | |
| Pipette Bulb | Fisher | 13-681-51 | |
| 40 ml Nalgene Teflon Centrifuge Tubes | Fisher | 05-562-16A | Teflon needed for hexane |
| Weigh Dishes (polypropylene) | Fisher | 2-202B | |
| 1.5 ml micro-centrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| Centrifuge | Sorvall | RC6plus | |
| Drying Oven (Fisher 625D) | Fisher | 13-254-2 | |
| Storage vials | Fisher | 0337-4 | |
| Bench-top microcentrifuge (Eppendorf 5415D) | Fisher | 05-40-100 | |
| Gravimetric Quantification | |||
| Porcelain Mortar (Coorstek) | Fisher | 12-961A | |
| Porcelain Pestle (Coorstek) | Fisher | 12-961-5A | |
| 40 ml Centrifugation tubes (FEP) | Fisher | 05-562-16A | Could also use glass tubes |
| Pasteur Glass Pipettes | Fisher | 13-678-20C | |
| Aluminum weigh dishes | Fisher | 08-732-101 | |
| Hexanes | Fisher | H292-4 | |
| Fluorometric quantification of oil content | |||
| Fluorescence multi-well plate reader | Thermo Lab Systems | Fluoroskan Ascent | |
| Fluorescence reader software | Thermo Lab Systems | Ascent Software 2.6 | |
| COSTAR 96 well plate with round bottom | Fisher | 06-443-2 | |
| Nile Red | Sigma | N3013-100MG | |
| Ethanol (Alcohol reagent grade) | Fisher | AC65109-0020 | |
| Imaging Fluorescent cells | |||
| Leica DMRXA2 (or equivalent) microscope | Leica | DMRXA2 | |
| Microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Microscope cover slips | Fisher | 12-541B | |
| Camera | Qimaging | Retiga Ex | |
| Imaging software | Qimaging | QCapture v.1.1.8 |
References
- Chisti, Y. Biodiesel from microalgae. Biotechnol. Adv. 25, 294-306 (2007).
- . National Algal Biofuels Technology Roadmap. Energy Efficiency & Renewable Energy. U.S. Department of Energy, Office of Energy Efficiency and Renewable Energy, Biomass Program. , (2010).
- de la Hoz Siegler, H., et al. Optimization of microalgal productivity using an adaptive, non-linear model based strategy. Bioresour. Technol. 104, 537-546 (2012).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A Rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).
- Hara, A., Radin, N. S. Lipid extraction of tissues with a low-toxicity solvent. Anal. Biochem. 90, 420-426 (1978).
- Han, Y., et al. Review of methods used for microalgal lipid-content analysis. Energ. Procedia. 12, 944-950 (2011).
- Pino, E. C., et al. Biochemical and high throughput microscopic assessment of fat mass in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (73), (2013).
- Sitepu, I. R., et al. An improved high-throughput Nile red fluorescence assay for estimating intracellular lipids in a variety of yeast species. J. Microbiol. Meth. 91, 321-328 (2012).
- Izard, J., Limberger, R. J. Rapid screening method for quantitation of bacterial cell lipids from whole cells. J. Microbiol. Meth. 55, 411-418 (2003).
- Chen, W., et al. A high throughput Nile red method for quantitative measurement of neutral lipids in microalgae. J. Microbiol. Meth. 77, 41-47 (2009).
- de la Hoz Siegler, H., et al. Improving the reliability of fluorescence-based neutral lipid content measurements in microalgal cultures. Algal Res. 1, 176-184 (2012).
- de la Jara, A., et al. Flow cytometric determination of lipid content in a marine dinoflagellate, Crypthecodinium cohnii. J. Appl. Phycol. 15, 433-438 (2003).
- Elsey, D., et al. Fluorescent measurement of microalgal neutral lipids. J. Microbiol. Meth. 68, 639-642 (2007).
- Feng, G. -. D., et al. Evaluation of FT-IR and Nile Red methods for microalgal lipid characterization and biomass composition determination. Bioresour. Technol. 128, 107-112 (2013).
- Guzmán, H., et al. Estimate by means of flow cytometry of variation in composition of fatty acids from Tetraselmis suecica in response to culture conditions. Aquacult. Int. 18, 189-199 (2010).
- Huang, G. -. H., et al. Rapid screening method for lipid production in alga based on Nile red fluorescence. Biomass Bioenerg. 33, 1386-1392 (2009).
- Lee, S., et al. Rapid method for the determination of lipid from the green alga Botryococcus braunii. Biotechnol. Tech. 12, 553-556 (1998).
- Montero, M., et al. Isolation of high-lipid content strains of the marine microalga Tetraselmis suecica for biodiesel production by flow cytometry and single-cell sorting. J. Appl. Phycol. 23, 1053-1057 (2011).
- Vigeolas, H., et al. Isolation and partial characterization of mutants with elevated lipid content in Chlorella sorokiniana and Scenedesmus obliquus. J. Biotechnol. 162, 3-12 (2012).
- Bertozzini, E., et al. Application of the standard addition method for the absolute quantification of neutral lipids in microalgae using Nile red. J. Microbiol. Meth. 87, 17-23 (2011).
- Kou, Z., et al. Fluorescent measurement of lipid content in the model organism Chlamydomonas reinhardtii. J. Appl. Phycol. , 1-9 (2013).
