Простой и быстрый протокол для измерения нейтральных липидов в клетках водорослей с помощью флуоресцентной
Summary
Простой протокол для определения нейтрального содержания жиров водорослевых клеток, используя процедуру Нил красные пятна описывается. Это экономия времени техника предлагает альтернативу традиционным гравиметрических основе липидов протоколов количественного. Она была разработана для конкретного применения мониторинга производительности биотехнологических.
Abstract
Водоросли считаются превосходными кандидатами для возобновляемых источников топлива из-за их природных возможностей хранения липидов. Прочная мониторинг водорослей процессов брожения и скрининга новых богатых нефтью штаммов требуется быстрый и надежный протокол для определения внутриклеточного содержания липидов. Существующие методы полагаться в значительной степени от гравиметрических методов определения содержания масла, методы, разработанные десятилетий назад, что занимает много времени и требует больших объемов образцов. В данной работе, Нил красный, флуоресцентный краситель, который был использован для идентификации присутствия липидов органов в многочисленных видов организмов, включена в простой, быстрой и надежной протокола для измерения нейтрального содержания жиров Auxenochlorella protothecoides, зеленый водоросли. Метод использует этанол, относительно мягкий растворитель, чтобы проницаемыми клеточную мембрану перед окрашиванием и 96 также микро-пластина для увеличения потенциала образца в процессе измерений интенсивности флуоресценции. Это был дизайнред с конкретного применения мониторинга производительности биотехнологических. Ранее высушенные образцы или живые образцы из растущей культуры могут быть использованы в анализе.
Introduction
Благодаря своей способности хранить липидов тела при определенных условиях стресса, водоросли получили большое внимание в последние годы в качестве потенциального источника возобновляемой топливной 1,2. Нейтральные липиды могут составлять более 60% от сухого веса клеток при соответствующих условиях роста 3. Тем не менее, промышленность не есть простой, чистый, быстрый и надежный стандартный протокол для количественного содержания жиров водорослевых клеток для того, чтобы должным образом контролировать работу Биопроцесс, анализа культур, и на экране, новых штаммов.
Гравиметрический метод Блай-Дайер разработан около 50 лет назад, остается одним из наиболее распространенных методов, используемых сегодня 4,5. Хотя эта процедура проста, надежна и легко осуществить, это отнимает много времени, требует больших объемов выборки, и делает использование токсичных растворителей. Это не практично для анализа много образцов из ферментации или скрининг для новых богатых нефтью штаммов. Другие методы бееп разработан, но, как правило, требуют современного оборудования и не были стандартизированы 6.
Альтернатива, которая собрала большое интерес представляет Нил красное пятно. Нил красный, краситель, который флуоресцирует преимущественно в неполярных средах, была использована для идентификации или количественной липидов тела в различных организмов, включая нематод 7, дрожжей 8, бактерий 9 и водорослей 10-19. Первоначальные методы с участием Нила Red были в основном качественными или полуколичественный, сочетая пятно с одной кюветы спектрофотометрии или проточной цитометрии. Кроме того, некоторые классы водорослей, таких как зеленые водоросли имеют толстые клеточные скважин, которые в основном непроницаемым для краски, что ограничивало диапазон технике 10.
Последние улучшения в методе Нил Красной окрашивания сообщалось, что обойти начальные недостатки протокола 10,11. Окрашивание клеток в присутствии CarrИОС растворителе, таком как ДМСО или этаноле 10 10,11 линеаризует взаимосвязь между содержанием масла и абсорбции, что позволяет надежных количественных измерений. Растворитель помогает проницаемыми клеточную мембрану так, что молекулы Нил Красные может пройти. Кроме того, включение спектрофотометра с возможностью считывания микро-пластин обеспечивает высокую пропускную способность протоколы, подходящие для количественного анализа.
В этой статье мы подробно простой метод для измерения содержания нефти в клетках водорослей путем окрашивания культур с Нила красный в присутствии этанола, мягким растворителем. Для того, чтобы наиболее точно учитывать фонового шума в измерениях, стандартная кривая корреляции интенсивности флуоресценции для содержания масла разработан с использованием водорослей клетки известного состава нефти. Метод заимствован из ранее опубликованных протоколов 10,11. С помощью спектрофотометра 96-луночный, один способен анализировать такое же количество образцов в час тхат бы занять несколько дней, чтобы следить по гравиметрических методов. Кроме того, при калибровке с использованием репрезентативных образцов желаемого вида водорослей этот метод производит относительно точные измерения, которые непосредственно интерпретировать. Там существует много протоколов с изложением методов окрашивания водоросли с видом на Нил красный, оптимизированный для различных штаммов и приложений; Протокол, представленные здесь был первоначально разработан де ла Ос Siegler др.. 11 для Auxenochlorella protothecoides, хлорелла, Scenedesmus dimorphus и Scenedesmus Obliquus, хотя вполне вероятно, подходит для многих больше видов и классов. Она была разработана с конкретного применения мониторинга производительности биотехнологических и она работает одинаково хорошо для ранее высушенных образцов и влажных образцов из растущего культуры.
Protocol
Representative Results
Discussion
Водоросли, используемый в стандартной кривой должен быть того же вида культивируют в тех же экспериментальных условиях, как и измеряется. Существенные изменения в составе средств массовой информации, техники выращивания, и протокола окрашивания может повлиять на интенсивность чтени?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить естественных и технических наук исследовательский совет Канады за предоставление финансовой поддержки для этого проекта.
Materials
| Dry Weight | |||
| 25 ml disposable pipettes | Fisher | 13-676-10K | |
| Pipette Bulb | Fisher | 13-681-51 | |
| 40 ml Nalgene Teflon Centrifuge Tubes | Fisher | 05-562-16A | Teflon needed for hexane |
| Weigh Dishes (polypropylene) | Fisher | 2-202B | |
| 1.5 ml micro-centrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| Centrifuge | Sorvall | RC6plus | |
| Drying Oven (Fisher 625D) | Fisher | 13-254-2 | |
| Storage vials | Fisher | 0337-4 | |
| Bench-top microcentrifuge (Eppendorf 5415D) | Fisher | 05-40-100 | |
| Gravimetric Quantification | |||
| Porcelain Mortar (Coorstek) | Fisher | 12-961A | |
| Porcelain Pestle (Coorstek) | Fisher | 12-961-5A | |
| 40 ml Centrifugation tubes (FEP) | Fisher | 05-562-16A | Could also use glass tubes |
| Pasteur Glass Pipettes | Fisher | 13-678-20C | |
| Aluminum weigh dishes | Fisher | 08-732-101 | |
| Hexanes | Fisher | H292-4 | |
| Fluorometric quantification of oil content | |||
| Fluorescence multi-well plate reader | Thermo Lab Systems | Fluoroskan Ascent | |
| Fluorescence reader software | Thermo Lab Systems | Ascent Software 2.6 | |
| COSTAR 96 well plate with round bottom | Fisher | 06-443-2 | |
| Nile Red | Sigma | N3013-100MG | |
| Ethanol (Alcohol reagent grade) | Fisher | AC65109-0020 | |
| Imaging Fluorescent cells | |||
| Leica DMRXA2 (or equivalent) microscope | Leica | DMRXA2 | |
| Microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Microscope cover slips | Fisher | 12-541B | |
| Camera | Qimaging | Retiga Ex | |
| Imaging software | Qimaging | QCapture v.1.1.8 |
References
- Chisti, Y. Biodiesel from microalgae. Biotechnol. Adv. 25, 294-306 (2007).
- . National Algal Biofuels Technology Roadmap. Energy Efficiency & Renewable Energy. U.S. Department of Energy, Office of Energy Efficiency and Renewable Energy, Biomass Program. , (2010).
- de la Hoz Siegler, H., et al. Optimization of microalgal productivity using an adaptive, non-linear model based strategy. Bioresour. Technol. 104, 537-546 (2012).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A Rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).
- Hara, A., Radin, N. S. Lipid extraction of tissues with a low-toxicity solvent. Anal. Biochem. 90, 420-426 (1978).
- Han, Y., et al. Review of methods used for microalgal lipid-content analysis. Energ. Procedia. 12, 944-950 (2011).
- Pino, E. C., et al. Biochemical and high throughput microscopic assessment of fat mass in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (73), (2013).
- Sitepu, I. R., et al. An improved high-throughput Nile red fluorescence assay for estimating intracellular lipids in a variety of yeast species. J. Microbiol. Meth. 91, 321-328 (2012).
- Izard, J., Limberger, R. J. Rapid screening method for quantitation of bacterial cell lipids from whole cells. J. Microbiol. Meth. 55, 411-418 (2003).
- Chen, W., et al. A high throughput Nile red method for quantitative measurement of neutral lipids in microalgae. J. Microbiol. Meth. 77, 41-47 (2009).
- de la Hoz Siegler, H., et al. Improving the reliability of fluorescence-based neutral lipid content measurements in microalgal cultures. Algal Res. 1, 176-184 (2012).
- de la Jara, A., et al. Flow cytometric determination of lipid content in a marine dinoflagellate, Crypthecodinium cohnii. J. Appl. Phycol. 15, 433-438 (2003).
- Elsey, D., et al. Fluorescent measurement of microalgal neutral lipids. J. Microbiol. Meth. 68, 639-642 (2007).
- Feng, G. -. D., et al. Evaluation of FT-IR and Nile Red methods for microalgal lipid characterization and biomass composition determination. Bioresour. Technol. 128, 107-112 (2013).
- Guzmán, H., et al. Estimate by means of flow cytometry of variation in composition of fatty acids from Tetraselmis suecica in response to culture conditions. Aquacult. Int. 18, 189-199 (2010).
- Huang, G. -. H., et al. Rapid screening method for lipid production in alga based on Nile red fluorescence. Biomass Bioenerg. 33, 1386-1392 (2009).
- Lee, S., et al. Rapid method for the determination of lipid from the green alga Botryococcus braunii. Biotechnol. Tech. 12, 553-556 (1998).
- Montero, M., et al. Isolation of high-lipid content strains of the marine microalga Tetraselmis suecica for biodiesel production by flow cytometry and single-cell sorting. J. Appl. Phycol. 23, 1053-1057 (2011).
- Vigeolas, H., et al. Isolation and partial characterization of mutants with elevated lipid content in Chlorella sorokiniana and Scenedesmus obliquus. J. Biotechnol. 162, 3-12 (2012).
- Bertozzini, E., et al. Application of the standard addition method for the absolute quantification of neutral lipids in microalgae using Nile red. J. Microbiol. Meth. 87, 17-23 (2011).
- Kou, Z., et al. Fluorescent measurement of lipid content in the model organism Chlamydomonas reinhardtii. J. Appl. Phycol. , 1-9 (2013).
