Method Article

Une nouvelle plate-forme d'étirement pour Applications dans cellulaire et tissulaire mécanobiologie

DOI:

10.3791/51454

⸱

June 3rd, 2014

 ,  ,  ,  , 
1Centre for Interdisciplinary NanoPhysics, Department of Physics, University of Ottawa, 2University of Ottawa Heart Institue, University of Ottawa, 3Libin Cardiovascular Institute of Alberta, University of Calgary, 4Department of Biology, University of Ottawa, 5Institute for Science, Society and Policy, University of Ottawa

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous présentons dans cet article une nouvelle plate-forme d'étirage qui peut être utilisé pour étudier les réponses des cellules individuelles à une déformation mécanique biaxial anisotrope complexe et quantifier les propriétés mécaniques des tissus biologiques.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Des outils qui permettent l'application de forces mécaniques de cellules et de tissus ou qui peuvent quantifier les propriétés mécaniques des tissus biologiques ont contribué considérablement à la compréhension de mécanobiologie de base. Ces techniques ont été largement utilisés pour démontrer comment l'apparition et la progression de diverses maladies sont fortement influencés par des signaux mécaniques. Cet article présente une plate-forme multi-fonctionnelle étirage biaxial (Baxs) qui peuvent soit stimuler mécaniquement des cellules individuelles ou de quantifier la rigidité mécanique des tissus. La plate-forme est constituée de quatre Baxs moteurs à bobine mobile qui peuvent être contrôlés de manière indépendante. Les cellules individuelles peuvent être cultivés sur un substrat flexible qui peut être attaché aux moteurs permettant une pour exposer les cellules à des champs de contraintes complexes, dynamiques, et variant spatialement. A l'inverse, par incorporation d'une cellule force de charge, on peut aussi quantifier les propriétés mécaniques des tissus primaires tels qu'ils sont exposés à des cycles de déformation.Dans les deux cas, un ensemble propre de pinces doit être conçu et monté sur les moteurs de plate-forme Baxs afin de maintenir fermement le substrat flexible ou le tissu d'intérêt. La plate-forme Baxs peut être monté sur un microscope inversé pour effectuer simultanément la lumière transmise et / ou de l'imagerie de fluorescence d'examiner la réponse structurelle ou biochimique de l'échantillon au cours d'expériences d'étirement. Cet article fournit des détails expérimentaux de la conception et de l'utilisation de la plate-forme Baxs et présente les résultats pour une seule cellule et études de tissus entiers. La plate-forme Baxs été utilisé pour mesurer la déformation des noyaux dans des cellules de myoblastes de souris individuelles en réponse au substrat souche et de mesurer la rigidité d'aortes de souris isolées. La plate-forme Baxs est un outil polyvalent qui peut être combiné avec différentes microscopies optiques afin de fournir de nouveaux aperçus mécanobiologique au niveau des tissus sous-cellulaire, cellulaire et tout.

Introduction

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Le micro-mécanique joue un rôle important dans de nombreuses fonctions cellulaires telles que la prolifération, la migration, la différenciation et qui ont un impact considérable dans le développement et l'homéostase des tissus et également dans des maladies 6.1. Au fil des ans, une multitude d'outils expérimentaux ont été utilisés pour stimuler mécaniquement les cellules ou les tissus et mesurer les propriétés mécaniques des tissus biologiques avec l'objectif d'accroître notre compréhension de mécanobiologie de base et l'étude de l'apparition et la progression des maladies 6-17. Cependant, il faut souvent compter plusieurs différents dispositif....

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Protocol

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1. Déformation mécanique des cellules individuelles

  1. Fabrication d'un substrat de PDMS avec des perles fluorescentes incorporées
    Avant la fabrication du substrat, les microsphères fluorescentes dans une solution d'eau sont remis en suspension dans de l'isopropanol pour améliorer bourrelet mélange dans les PDMS à cause de son caractère hydrophobe.
    1. Introduire à la pipette 500 ul de microsphères fluorescentes dans un tube à centrifuger de 1,5 ml et centrifuger à 16 200 xg pendant 10 min.
    2. Jeter le surnageant et ajouter 500 ul d'isopropanol suivi à 5 min de vortex. Mettez le flacon de côté toute la nuit dans l'obscurité afin de permettre ....

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Results

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Cellule Stretching

La plate-forme Baxs a été utilisé pour étudier la réponse mécanique du noyau dans des cellules de myoblastes de souris simples (C2C12) est exposé à une déformation de substrat de 25%. Cellules myoblastes sont trouvées dans les tissus musculaires et sont constamment exposés à un étirement et une compression mécanique in vivo. Les propriétés de la forme et mécaniques du noyau cellulaire ont montré à jouer un rôle majeur dans la régulation de l'expre.......

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Discussion

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La plate-forme Baxs présenté ici facilite de nombreuses expériences dans l'étude de mécanobiologie, des enquêtes de cellules individuelles dans les tissus entiers. En outre, la plate-forme est très flexible et configurable, permettant ainsi à de nombreuses expériences de stimulation mécanique et les essais de traction multi-axiale. La plate-forme permet en outre le maintien des cellules et des tissus dans des conditions physiologiques et permet une microscopie simultanée au cours d'expériences d'étirement. L.......

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Disclosures

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Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.

Acknowledgements

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DT a été soutenue par une bourse de recherche postdoctorale de Le Fonds de recherche du Québec-Nature et Technologies (FQRNT) et un MITACS Elevate bourse stratégique. CMC a été soutenue par une bourse postdoctorale du Fonds le de Recherche en Santé du Québec (FRSQ) et Ernest et Margaret Ford cardiologie doté bourse de recherche de l'Université de l'Institut de cardiologie d'Ottawa. EOB a été soutenu par des subventions d'exploitation MOP80204 de l'Institut canadien de recherche en santé du Canada (IRSC) et T6335 de la Fondation des maladies de l'Ontario. Les IRSC et Medtronic fournissent collectivement EOB avec une chaire de recherche évaluées....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
PDMSEllsworth Adhesives184 SIL ELAST KIT 0.5KGLe rapport base/réticulant utilisé dans ce protocole est de 20:1. Mélangez dans un capot laminaire pour empêcher la poussière de contaminer votre  ;
FluoSpheres microsphères fluorescentesInvitrogenF8810Tenir à l’abri de la lumière.
Bobine mobile linéaireMoticontLVCM-051-051-01Le motro est livré en deux pièces (aimant et bobine). Il doit être monté sur un système de roulement à billes pour être fonctionnel.
Glissière à roulement à billesEdmund OpticsNT37-360Glissières à roulement à billes à mouvement linéaire miniatures et petites Platines
positionnement linéaire EdmundOptics38-960Entraînement central 1,25" Étages de translation linéaire carrés
Codeur optiqueGSI microE systèmes MercuryII 1600S - Encodeur incrémental réfléchissant de résolution 0,5um.
Contrôleur de mouvementGalilDMC-2143(DIN)-DC48 avec AMP-20440Contrôleur 4 axes avec amplificateur 4 axes
Capteur de chargeminiature Honeywell31 avecune plage de 0 à 150 g
Goupilles de minutiens d’insectes (0,20 mm)Service de goupilles Austerlitz GoupillesGoupilles en acier inoxydable pliées en forme de triangle ouvert
SU-8 2050Micro ChemSU-8 2050Photorésine négative époxy permanente. Tenir à l’abri de la chaleur et de la lumière
Système de traitement air-plasmaGlowresearchAutoglow Oxygen Plasma System
Collagène à queue de ratInvitrogenA10483-01Collagène I, queue de rat 5 mg/ml
Hoechst 33342InvitrogenR37605Colorant fluorescent spécifique à l’ADN. Conserver au réfrigérateur.
Résistances flexibles isolées Kapton (film polyimide)omega.caKHLV-0504/(10)-P28 V ; peuvent être fournies avec un
régulateur de température et de processus 24 V 1/16 DIN Autotuneomega.caCN63200-R1-LVRégulateur de température ; alimentation 24 V.
Milieu de cultureDMEM HycloneSH3024301Dulbecco' s Modifié 30 Eagle Medium. Garder à 4 ° ; C
Pénicilline-StreptomycineHycloneSV30010Conserver le bouillon congelé. Maintenir la solution de travail à 4 ° ;C.
Sérum fœtal bovin (FBS)HycloneSH3039603CConserver congelé.
Trypsine 0.05 %HycloneSH30236.02Conserver congelé. Digestion des protéines d’attachement cellulaire pour la sous-culture
HepesWisent Inc330-050-ELSolution saline tamponnée HEPES  ;
NaClFisher ScientificBP358-1Solution saline tamponnée HEPES / Solution physiologique Krebs
KClFisher ScientificBP366-500Solution saline tamponnée HEPES / Solution physiologique Krebs
MgSO4Fisher ScientificM65-500Solution saline tamponnée HEPES / Solution physiologique Krebs
CaCl2Fisher ScientificC614-500Solution saline tamponnée HEPES / Solution physiologique de Krebs
DextroseFisher ScientificBP220-1Solution saline tamponnée HEPES / Solution physiologique de Krebs
NaHCO3Fisher ScientificBP328-1Solution physiologique de Krebs
KH2PO4Fisher ScientificBP362-500Solution physiologique de Krebs
Carbogen 95 % O2/5 % CO2LindleDIN :02154749Krebs solution physiologique Oxygénation
NocodazoleSigmaM1404Agent de dépolymérisation des microtubules
Cytochalasine-DSigmaC8273Agent de dépolymérisation des filaments d’actine
Anti-&alpha ;- SMA-FITCSigmaF3777Utilisé pour colorer et quantifier la teneur en cellules musculaires lisses
Coloration rouge PicrosiriusFluka43665Utilisé pour colorer et quantifier la teneur en collagène
de anti-insectes les résistances flexibles

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yim, E. K., Sheetz, M. P. Force-dependent cell signaling in stem cell differentiation. Stem Cell Res Ther. 3, (2012).
  2. Vogel, V., Sheetz, M. Local force and geometry sensing regulate cell functions. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 265-275 (2006).
  3. Wang, N.....

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Biaxial Stretching PlatformMechanical DeformationCell MechanobiologyTissue Stiffness MeasurementVoice Coil MotorsFlexible SubstrateInverted MicroscopyFluorescent MicrospheresPDMS FabricationAortic Tissue Analysis

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