Ribosomer spille en sentral rolle i proteinsyntesen. Polyribosome (polysome) fraksjonering av sukrose tettshetsgradient sentrifuge tillater direkte bestemmelse av omregnings effektiviteten av individuelle mRNA på et genom-wide skala. I tillegg kan denne fremgangsmåte benyttes for biokjemisk analyse av ribosom-og polysome-assosierte faktorer som anstand og signalmolekyler.
mRNA oversettelses spiller en sentral rolle i reguleringen av genekspresjon, og representerer den mest energikrevende prosess i pattedyrceller. Følgelig blir feilregulering av mRNA oversettelses anses å spille en viktig rolle i en rekke patologiske tilstander, inkludert kreft. Ribosomer også vert anstand, som letter folding av begynnende polypeptider, dermed modulerende funksjon og stabilitet nysyntetiserte polypeptider. I tillegg er nye data indikerer at ribosomer tjene som en plattform for et repertoar av signalmolekyler, som er implisert i en rekke post-translasjonelle modifikasjoner av nylig syntetiserte polypeptider som de kommer fra ribosomet, og / eller komponenter av translasjons-maskineri. Heri er en veletablert metode for ribosom fraksjonering ved hjelp av sucrose-densitets-gradient sentrifugering er beskrevet. I forbindelse med den egenutviklede "anota" algoritmen denne metoden tillater direkte bestemmelse av forskjellerrential oversettelse av individuelle mRNA på et genom-wide skala. Videre kan denne allsidige protokollen brukes til en rekke biokjemiske studier tar sikte på å dissekere funksjonen av ribosom-assosiert protein komplekser, inkludert de som spiller en sentral rolle i folding og degradering av nysyntetiserte polypeptider.
De regulatoriske nettverk som styrer genuttrykk har blitt grundig studert i de siste to tiårene. De aller fleste av disse forskningsinnsats fokusert på transkripsjonsregulering, der endringer i steady-state mRNA nivåer på et genom-wide skala ble brukt til å bestemme såkalte "genuttrykk" profiler. Nyere studier viser at steady-state mRNA nivåer bare løst tilsvarer sammensetningen av proteomet 1,2, og dermed indikerer at de post-transcriptional mekanismer, inkludert mRNA oversettelse, spille en viktig rolle i regulering av genuttrykk 3,4. Faktisk har det vært anslått at ~ 50% av protein nivåer fastsettes på nivået av mRNA oversettelse i udødelig musefibroblaster fem.
mRNA oversettelse er en svært regulert prosess der mRNA er oversatt til proteiner via orkestrert handling av ribosomer, transfer RNA (tRNAs) og tilbehørs faktorer commonly referert til som omregningsfaktorer (TFS) 6. Proteinsyntesen er den mest energikrevende prosess i pattedyrceller 7 og derfor globale mRNA omregningssatsene justeres for å imøtekomme celleproliferasjon priser åtte næringsstoffer og. I tillegg til endringer i globale mRNA oversettings priser, ulike ekstracellulære stimuli (f.eks hormoner og vekstfaktorer), intracellulære signaler (f.eks aminosyre nivåer) og ulike typer stress (f.eks ER-stress) induserer selektive endringer i bassengene av mRNA som er blir oversatt (translatome) 6. Avhengig av typen av stimuli, oversettelse aktivitet av noen, men ikke alle mRNA blir dramatisk påvirket, og derved resulterer i forandringer i proteomet som kreves for å montere en rask cellulær respons 6.. Disse kvalitative og kvantitative forandringer i translatome er antatt å bli mediert av samspillet mellom trans-virkende faktorer (f.eks </em> komponenter av translasjonsforskning maskiner, hjelpe faktorer eller mirnas) og cis-elementer (RNA elementer eller funksjoner) som finnes i utvalgte undergrupper av mRNA 6,9. For eksempel endringer i nivåene og / eller aktivitet av hastighetsbegrensende oversettelse initiering faktorer eIF4E og eIF2 selektivt modulere oversettelse av vitnemål basert på de spesifikke 5'UTR funksjoner seks. eIF4E og eIF2 er nødvendig for rekruttering av mRNA og initiator tRNA til ribosomet, henholdsvis seks. En økning i eIF4E aktivitet selektivt styrker oversettelse av mRNA skjuler lange og svært strukturerte 5'UTRs inkludert de koding spredning og overlevelse stimulerende proteiner inkludert sykliner, c-myc og BCL-XL 10. I sin tur, inaktivering av eIF2 fører til en global proteinsyntese stansen, samtidig som selektivt opp regulere oversettelse av mRNA inneholdende korte inhiberende oppstrøms åpne leserammer (uORFs) i sine 5'UTRs, slik som de som koder hoved transcriptional regulatorer av utbrettet protein respons (f.eks ATF4). I respons til forskjellige stimuli inkludert næringsstoffer, vekstfaktorer og hormoner, det mekanistiske / pattedyr målet for rapamycin (mTOR) pathway stimulerer eIF4E aktivitet ved å inaktivere 4E-bindende protein (4E-BP) familie av oversettingsdempere, mens MAPK veien fosforylerer direkte eIF4E 6,11. I sin tur, eIF2α kinaser (dvs. perk, PKR, HRI og GCN2) hemme eIF2 ved fosforylerende sin eIF2α regulerende subenhet som svar på næringsmangel, ER-stress og virus infeksjon 6,12. Endringer i aktiviteten og / eller ekspresjon av TFS, har andre komponenter i maskiner og translasjonelle regulatoriske faktorer, inkludert miRNAs blitt observert i forskjellige patologiske tilstander inkludert kreft, metabolsk syndrom, nevrologiske og psykiatriske lidelser, og nyre-og hjerte-karsykdommer 13-19. Sammen er disse dataene indikerer at translasjonell megchanisms spille en sentral rolle i å opprettholde celle homeostase og at deres opphevelse spiller en sentral rolle i etiologien av ulike menneskelige sykdommer.
Heri er en protokoll for fraksjonering av polysomes med sukrose-densitets-gradient sentrifugering i pattedyrceller, som anvendes for å skille polysomes fra monosomes, ribosomale subenheter og messenger ribonucleoprotein partikler (mRNPs) er beskrevet. Dette gjør at diskriminering mellom effektivt oversatt (assosiert med tunge polysomes) fra dårlig oversatt (assosiert med lys polysomes) mRNA. I denne analysen blir ribosomer immobilisert på mRNA ved hjelp av oversettelsesforlengelses hemmere som cykloheksimid 20 og cytosoliske ekstrakter blir separert på 5-50% lineær sukrose densitetsgradienter ved ultrasentrifugering. Etterfølgende fraksjonering av sakkarosegradienter tillater isolering av mRNA i henhold til antallet av ribosomer de binder seg til. RNA ble ekstrahert fra hver fraksjon kan deretter brukes til å bestemmeendringer i fordelingen av mRNA over gradient mellom forskjellige forhold, hvorved translasjonelle effektivitet øker fra toppen til bunnen av gradienten. Northern blotting eller kvantitativ revers transkripsjon polymerasekjedereaksjon (QRT-PCR) benyttes for å bestemme nivået av mRNA i hver fraksjon.
Alternativt, er fraksjoner som inneholder tung polysomes (vanligvis mer enn tre ribosomer) samles og genome-wide polysome-assosiert mRNA nivåer er fastsatt ved bruk av microarray eller dyp-sekvensering. Det er av største viktighet å understreke at nivåene av polysome-forbundet mRNA er, i tillegg til oversettelse, påvirket av transkripsjons og post-transcriptional mekanismer som påvirker cytosoliske mRNA nivåer 21. Derfor, for å bestemme forskjeller i oversettelse ved hjelp av genomdata fra polysome-assosiert mRNA er det nødvendig å korrigere for effektene av trinnene i genekspresjon bane som er oppstrøms for omregsjon 21. Å tillate en slik korreksjon, er cytosolic RNA utarbeidet parallelt med polysome-assosiert RNA fra hver prøve, og de genome-wide steady-state mRNA nivåer fastsettes 21. Foreløpig såkalt "oversettelse effektivitet" (TE) score (dvs. log-ratio mellom polysome-assosiert mRNA data og cytosoliske mRNA data) blir ofte brukt til å korrigere for effekten av endringer i cytosoliske mRNA nivåer på oversettelses effektiviteten av en gitt mRNA 22. Imidlertid, ved hjelp av TE-score for å identifisere differensial oversettelsen er forbundet med et betydelig antall falske positive og falske negative resultater på grunn av en matematisk egenskap for TE resultatet ofte referert til som falsk korrelasjon 27.. Faktisk en undersøkelse av datasett fra flere laboratorier indikerte at slike falske sammenhenger synes å være uunngåelig når analysere endringer i translatomes 23. Dette fikk utviklingen av "analyse av differensial tr anslation "(anota) algoritme, som ikke lider av de nevnte svakheter 23. Under anota-analyse en regresjon modellen brukes til å utlede tiltak av translasjonell aktivitet uavhengig av cytosoliske RNA nivåer. Slike tiltak blir så sammenlignet mellom forhold og en statistikk beregnes. Brukeren har muligheten til å bruke en varians krymping metoden, som forbedrer statistisk styrke og reduserer forekomsten av falske positive funn i studier med få replikater 24. Betydelig, ble det nylig vist at forstyrrelsene i translatome fanget av anota, men ikke TE score, korrelerer med endringer i proteomet 25. Derfor er det sterkt anbefalt å bruke anota analyse for identifisering av endringer i oversettelse på et genom-wide skala. Mens de teoretiske fundamentet for den anota algoritmen ble diskutert i detalj tidligere 21,23,26, her er fokus på hvordan å bruke den i praksis.
ve_content "> I tillegg til å studere endringer i mRNA oversettelse aktivitet i cellen, kan dette ribosom fraksjone protokollen brukes til å isolere og biokjemisk og funksjonelt karakter ribosom-og polysome-assosiert protein komplekser. Denne tilnærmingen har med hell vært utplassert i det siste til å identifisere komplekser som regulerer stabiliteten av nylig syntetiserte polypeptider 27 og / eller er involvert i fosforyleringen av komponentene i den translasjonelle maskiner. Denne anvendelsen av polysome fraksjoneringsmetode vil også bli kort omtalt.Denne artikkelen beskriver et veletablert polysome fraksjone protokollen etterfulgt av et egenutviklet analysemetode for å fange kvalitative og kvantitative endringer i translasjonell aktivitet på et genom-bred skala i pattedyrceller. For vellykket gjennomføring av denne protokollen spesiell oppmerksomhet bør rettes mot en) Cell confluency (som spredning priser og næringsstoffer korrelerer med mRNA oversettelse aktivitet og kan påvirke sammensetningen av translatome, bør celle confluency være konsistente på tvers gjentak og eksperimentelle forhold), 2) Rapid cellelyse (Uavhengig tilstedeværelsen av cycloheximide og RNase hemmere i buffere, bør lyse være rask og cellulære ekstrakter bør legges over sakkarosegradienter umiddelbart etter lysering for å hindre RNA degradering og dissosiasjon av polysomes), 3) Gradient forberedelse (for å sikre høy data reproduserbarhet, bør sakkarosegradienter bli utarbeidet etter den gradient maker og spesielle forsiktighet bør utvises ved håndtering av dem).
I tillegg til å studere endringene i translasjons-aktivitet, kan denne protokollen kan brukes for å isolere ribosom-assosiert protein-komplekser og etablere deres fysiologiske funksjoner. For dette formål kan nivåer og fosforylering statusen til forskjellige ribosom-assosiert protein bestemmes ved TCA nedbør, etterfulgt av Western blotting, mens ribosom-assosiert protein-komplekser kan immunoutfelt fra graderte fraksjoner og analysert ved Western blotting eller masse-spektrometri. En begrensning ved denne teknikken er at den langsomme gradient fraksjon metoden kan føre til dissosiasjon av enda tett bundne proteinene som har bindingskinetikken er i rask krets / dissosiasjon. Faktorer knyttet til nysyntetiserte polypeptider er typiske eksempler. Nylig syntetiserte polypeptider vekst danne ribosomene kan bli immobilisert på protein komplekser forbundet med ribosomer ved anvendelse av kjemiske tverrbindings eksempel 3, 3'-ditiobis [sulfosuccinimidylpropionate] (DTSSP) 31. Denne tilnærmingen avdekket at Receptor for Aktivert C Kinase 1 (RACK1) / c-Jun N-terminal kinase (JNK) / eukaryote oversettelse elongeringsfaktor 1A2 (eEF1A2) kompleks regulerer nedbrytning av nysyntetiserte polypeptider som svar på stress 27. I tillegg ble det tilsvarende metodikk som brukes i studier som viser at protein kinase C BII (PKCbII) er rekruttert til ribosomer etter RACK1 32 og at aktivering av mTOR kompleks 2 (mTORC2) skjer på ribosomene hvor det phosphorylates nysyntetiserte AKT polypeptider og regulerer deres stabilitet 33,34.
Store begrensninger av polysome fraksjoneringsmetode etterfulgt av anota analyse er: 1) behovet for et relativt høyt antall celler (~ 15 x 10 6 celler), 2) mangel på posisjonsinformasjon vedrørende lokalisering av ribosomet på en gitt mRNA-molekylet, og 3 ) spørsmål knyttet til mobilnettet og molekylære heterohomogenitet av normale og tumorvev. Problemstillinger knyttet til nødvendig celle nummer kan løses ved å justere absorpsjonsspektra topper tilsvarende monosomes (80-tallet) av celler der beløpene er begrensende med de hentet fra høy overflod celler (f.eks HeLa-celler) 35. Ribosomet profilering teknikk (se nedenfor) kan brukes til å bestemme eksakt posisjonen av ribosomet på en gitt mRNA molekyl, mens samtidig andre problemer knyttet til virkninger av vev heterogenitet på tolkningen av endringer i genekspresjon fremstilt av komplekse systemer, for eksempel humane vev er diskutert i detalj i en publikasjon av Leek og Storey 36.
Nylig ble en ny ribosom profilering teknikk utviklet, karakterisert ved at ribosomet beskyttede fragmenter (RPFs) er generert ved behandling RNAse I og analysert ved hjelp av dyp-sekvensering 22.. Denne teknikken tillater bestemmelse av ribosomet stilling ved et enkelt nukleotid-oppløsning, og dermed gi hittil unprecedented innsikt i ribosom biologi. For eksempel kan ribosom profilering anvendes for bestemmelse av ribosomet tettheten på en gitt mRNA molekyl eller identifisering av elementer som påvirker translation initiation priser som de alternative initiering områder, initiering ved ikke-august kodon og regulatoriske elementer som uORFs. Imidlertid er det flere metodiske begrensninger som begrenser muligheten for ribosomet profilering å nøyaktig beregne-mRNA-translasjonen effektivitet. Disse inkluderer uavhengige skjevheter introdusert av tilfeldige fragmentering og RNAse jeg fordøyelse, skjevheter introdusert av oversettings hemmere (f.eks tøyelighet hemmere som Emetine og cycloheximide er sannsynlig å indusere ribosom akkumulering ved oversettelse initiering nettsteder), et stort antall falske positive og falske negative resultater forbundet med TE score så vel som deres unøyaktighet i å forutsi den leser som kommer fra protein koding mRNA 37. Kanskje viktigst, mensribosom profilering tillater direkte identifisering av ribosom posisjon på en gitt mRNA molekyl, er antallet ribosomer som er forbundet med en gitt mRNA indirekte anslått ved å normalisere frekvenser av lyder i RPFs (ribosom-assosiert mRNA) over dem observert i tilfeldig fragmenterte mRNA (total mRNA). For eksempel vil i en enkel innstilling hvor fire "B"-mRNA-molekyler (Ba, Bb, BC og BD) er okkupert av fire ribosomer i stillingene 1, 2, 3 og 4, en iboende begrensning ved ribosomet profilering teknikk ikke tillate et skille mellom et scenario hvor alle 4 ribosomer forbinder bare med en Ba-mRNA i stillingene 1, 2, 3, og 4 og et scenario hvor Ba, Bb, Bc og Bd mRNA hver er opptatt av en enkelt ribosom i posisjon 1, 2 , 3 og 4, respektivt. I motsetning til dette i løpet av polysome fraksjonering, blir polysome integritet bevares, noe som gjorde at isolering av bassenger av mRNA forbundet med et definert antall ribosomer (fig. 1). Denne importenmaur skille mellom polysome fraksjonering og ribosom profilering antyder at mens den førstnevnte metode kan brukes til å direkte sammenligne mRNAs in mRNP, lette og tunge polysome fraksjoner, den sistnevnte metode vil sannsynligvis mislykkes i å fange opp endringer i translatome som er forårsaket av mRNA som overgang fra lett til tung polysomes, mens estimere bidraget av de som flytter fra mRNP brøk til tunge polysomes. Den biologiske betydningen av disse avvikene mellom de nevnte metodene er understreket av en stor mengde data som viser at translasjonsforskning aktivering av en undergruppe av mRNA som de som er eIF4E-sensitive, overgang fra lys til tunge polysomes, mens andre, slik som de skjuler 5'TOP elementer, blir rekruttert til tunge polysomes direkte fra bassenger av ribosom-fri mRNA seks. Interessant nok har den mTOR veien vist seg å samtidig modulere oversettelsen av "eIF4E-sensitive" og 5'TOP mRNA enEn. Derfor metodiske forskjeller som er omtalt ovenfor kan forklare den tilsynelatende uoverensstemmelse av konklusjonen mellom studier med ribosom profilering 38,39 og polysome fraksjone 24 for å vurdere effekten av mTOR-hemming på translatome.
Som konklusjon, polysome fraksjonering og ribosom profilering er komplementære fremgangsmåter som i første rekke gir informasjon angående antallet ribosomer forbundet med mRNA og posisjonen til ribosomet på mRNA, respektivt. Viktigere, til tross for svakhetene og fordelene av disse metodene, er det fortsatt viktig at de genome-wide data innhentet av både prosedyrer er tilstrekkelig analysert og funksjonelt og biokjemisk validert.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble støttet av den kanadiske Institutes of Health Research Grant (CIHR MOP-115195) og FRQ-S til det, som også er en mottaker av CIHR Young Investigator Award; og det svenske Vetenskapsrådet og det svenske Kreftforeningen til OL
HEPES | Biobasic | HB0264 | |
MgCl 2 | Sigma | M8266 | |
KCl | VWR | CABDH4532 | |
Dithiothreitol (DTT) | Biobasic | DB0058 | |
Tris | Biobasic | TB0196 | |
Glycoblue | Ambion | AM9515 | RNA precipitation carrier |
Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750 | |
Triton X-100 | Sigma | X100 | |
Cycloheximide | Sigma | C1988 | |
Protease inhibitor cocktail | Roche | 04693132001 | Tablets (EDTA-free) |
RNase inhibitor | Promega | N2515 | |
0.45 µm Filter System 150 ml | Corning | 431155 | |
Sucrose | Sigma | S0389 | |
RNeasy MinElute Cleanup kit | Qiagen | 74204 | RNA cleanup kit |
Thin wall polyallomer ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
Equipments | |||
SW41Ti Rotor Package with accessories | Beckman Coulter | 331336 | |
Optima L100 XP ultra centrifuge | Beckman Coulter | DS-9340A | |
ISCO fraction collector | Brandel | FC-176-R1 | |
Type II Detector with Chart Recorder | Brandel | UA-6 | UV detector |
Tube Piercer w/Flow Cell and Syringe Pump | Brandel | BR-A86-5 | |
UA-6 Detector Cable | Brandel | 60-1020-211 | |
FC-176 Communication Cable | Brandel | FCC-176 | |
Gradient Master Base Unit | Biocomp | 108-1 | Gradient Maker |
Gradient Forming Attachments | Biocomp | 105-914A-1R | Gradient Maker attachment |
Measurement Computing 8-channel 50kHz Data Acquisition Device | MicroDAQ | USB-1208FS | Analysis software attachment |
Measurement Computing Data Acquisition Software | MicroDAQ | TracerDAQ Pro | Analysis software (Download only) |
Buffers | |||
10X buffer for sucrose gradients: | |||
200 mM HEPES (pH7.6) | |||
1 M KCl | |||
50 mM MgCl2 | |||
100 µg/ml cycloheximide | |||
1x protease inhibitor cocktail (EDTA-free) | |||
100 units/ml RNase inhibitor | |||
Lysis buffer | |||
5 mM Tris-HCl (pH7.5) | |||
2.5 mM MgCl2 | |||
1.5 mM KCl | |||
1x protease inhibitor cocktail (EDTA-free)] | |||
Then add cycloheximide (CHX), DTT, RNAse inhibitor, Triton and Sodium Deoxycholate as indicated in the main text |