בשיטה חוץ גופית כדי לבחון אינטראקציות בתיווך-E-selectin בין תאים סרטניים בערמונית מחזור שמקורם בתאי חולים ואנדותל האנושי
Summary
הדוח שלנו מתאר שיטה ייחודית כדי לחזות ולנתח אינטראקציות CTC / EC בסרטן הערמונית בתנאי זרימה פיסיולוגיים.
Abstract
גרורות היא תהליך שבו תאים סרטניים לשפוך ממערכת הלימפה וכלי דם גידול הראשוני intravasate דם, ובכך לקבל גישה לextravasate ויוצר נישה משני. Extravasation של תאים סרטניים ממערכת כלי דם דם ניתן ללמוד באמצעות תאי אנדותל (ECs) ותאים סרטניים המתקבלים משורות תאים שונות. מחקרים ראשוניים שנערכו באמצעות תנאי סטטי, אבל זה כבר מתועד היטב כי ECs מתנהג באופן שונה בתנאי זרימה פיסיולוגיים. לכן, מכלולי תא זרימה שונים משמשים כיום לחקר אינטראקציות של תאי סרטן עם ECS. מכלולי תא הזרימה הנוכחיים מציעים תוצאות לשחזור או באמצעות קווי תאים שונים או נוזל בתנאי לחץ גזירה שונה. עם זאת, כדי להתבונן וללמוד אינטראקציות עם תאים נדירים כגון מחזורי תאים סרטניים (CTCs), שינויים מסוימים נדרשים להתבצע להרכבת תא זרימה הקונבנציונלית. CTCsהם אוכלוסיית תאים נדירה בין מיליון של תאי דם. כתוצאה מכך, קשה להשיג אוכלוסייה טהורה של CTCs. זיהום של CTCs עם סוגים שונים של תאים בדרך כלל נמצאים במחזור הדם הוא בלתי נמנע באמצעות העשרה בהווה או בטכניקות דלדול. בדו"ח הנוכחי, אנו מתארים שיטה ייחודית לתאים סרטניים fluorescently תווית במחזור ערמונית וללמוד האינטראקציות שלהם עם ECs במערכת תא זרימה עצמית התאספו. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת נוספת לצפות אינטראקציות בין CTCs ערמונית וכל חלבון של עניין.
Introduction
גרורות היא תהליך רב שלבים מורכבים שנשאר הבינו היטב. ציר יגנד E-selectin/selectin הוכח לשחק תפקיד חשוב בגרורות סרטניים על ידי קידום אינטראקציות דבק עיקריים בין האנדותל של כלי הדם והתאים סרטניים 1,2. אנדותל (E)-selectin הוא חלבון הטרנסממברני לידי ביטוי על ידי תאי האנדותל הופעלו, ואילו ליגנד שונה E-selectin (ים) באים לידי ביטוי על ידי תאי גידול 3. במבחנה גישות רבות כבר מועסקות בהצלחה למודל אינטראקציות E-selectin/selectin יגנד בין תאים סרטניים ותאי אנדותל (ECs) 1. כדי לחקור אינטראקציות אלה, מערכות תא זרימה שונות להיות מועסקות כדי לדמות מערכת כלי דם בדם. בין מכלולי תא זרימה, חדר זרימת לוחות מקבילים (PPFC) בשיתוף עם ECs משמש באופן שגרתי כמבחנת מודל בהדמיה בתנאי לחץ הגזירה vivo. בזהשיטה, ECS גדלים על צלחת 35 מ"מ ולאחר השיג monolayer, ECS מחוברים PPFC וניסויים מבוססי מאמץ גזירה מבוצעים.
עם זאת, PPFC ומערכות שוטפות אחרות להציג מגבלות רבות לחקר אינטראקציות דבק בין תאים סרטניים במחזור (CTCs) נגזרים מחולים וECS, בעיקר, כי CTCs הוא אוכלוסייה נדירה של תאים, לשפוך מן הגידול הראשוני, במחזור בין מיליוני תאי דם (1 CTC לכל 10 9 תאי דם) 4. לפיכך, בניגוד לאספקה בלתי מוגבלת של שורות תאים בתרבית, ספירת CTC נמוכה להוביל לאינטראקציות CTC / EC כמה ונדירות מאוד, הדורשת רוחב ערוץ זרימה נכון כדי להקליט את האינטראקציות לניתוח השמעה. בנוסף, מאז CTCs נגזר המטופל הוא אוכלוסייה טמאה, ולכן סמן זיהוי נדרש כדי לעקוב אחר CTCs בספציפי. כדי לפתור בעיה זו, פיתחנו שיטה חדשה לזיהוי סרטן הערמונית (PCA) CTCs על ידי ניצול של העובדה שכמעט כל CTCs אלה מבטאים אנטיגן הספציפי לערמונית קרום (PSMA) על פני התא שלהם 5,6. בדו"ח זה, השתמשנו בשורת תאי סרטן הערמונית, מד"א PCa2b (מד"א), כדי להדגים את התועלת הפוטנציאלית של המערכת החדשה שלנו כדי לחקור אינטראקציות CTC ערמונית עם ECS, סופו של דבר להבין את המנגנון של גרורות.
המתודולוגיה שלנו יכולה להיות מיושמת על ניסויי גזירה מבוססות שונים לדמות במערכת כלי דם vivo 7-9. חוץ מבחינת אינטראקציות PCA CTC / EC, מערכת תא הזרימה הנוכחית יכולה להתאים בקלות לניתוח תאי הדם היקפיים mononuclear או אינטראקציות של התאים סרטניים עם ECS. הקלות של פירוק והרכבה של תא הזרימה, microslide III (0.1) (להלן כmicroslide), מאפשרת culturing ECs תחת זלוף ומגרה ECs עם ציטוקינים שונים כדי לגרום ליחסי ציבורotein ביטוי. חוץ מזה, ECs התרבותי, יכולים להיות מצופים חלבונים רקומביננטיים כגון E-ו-P-selectin על microslide ואינטראקציות עם תאים סרטניים יכול להיות שנצפה בתנאי זרימה למינרית 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
בשל המספר הנמוך של CTCs בין תאי דם, קשה לבודד CTCs כאוכלוסייה טהורה של תאים. כדי לחקור אינטראקציות CTC / EC, האוכלוסייה נדירה וטמאה של CTCs מציבה שני אתגרים מרכזיים: א) זיהוי של CTCs בין תאי דם; ב) תצפית של אינטראקציות CTC / EC.
<p class="jove_content" style=";tex…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מימון מתכנית משרד ההגנה-ערמונית חקר הסרטן (W81XWH-12-1-0124), U54CA143876 מהמכון הלאומי לסרטן, ורוברט McCooey המין והשתן אונקולוגיה קרן המחקר. ברצוננו להודות לד"ר Annarita ורנצו (מחלקה לפתולוגיה) על מתן נוגדני VE-cadherin, וד"ר מרקו Seandel (מחלקה לכירורגיה) למתן HUVECs.
Materials
| Microslide | Ibidi | 80331 | |
| Fibronectin | Millipore | FC010 | |
| Plastic tubing | Tygon | AAQ04103 | |
| Male luer adapter | GlycoTech | 31-001 | |
| Female luer adapter | GlycoTech | 31-001 | |
| Syringe pump | Chemyx Inc | Fusion 100 | |
| Luer-lock syringe | BD Biosciences | 309628 | |
| M199 medium | Sigma | M7653 | |
| Endothelial Mitogen | Biomedical Technologies | BT-203 | |
| HBSS | Sigma | H9269 | |
| Anti-PSMA J591-488 | Weill Cornell Medical College-Lab of Urologic Oncology | ||
| Interleukin-1 beta | Peprotech | 200-01B | |
| Trypsin | Millipore | SM-2002-C | |
| Heparin | Sigma | H-3149 | |
| HUVECs | Weill Cornell Medical College-Department of Surgery | provided by Marco Seandel | |
| VE-Cadherin | Santa Cruz | sc-5648 | |
| 10x objective | Zeiss Plan Neofluar | ||
| Enzyme free cell dissociation reagent | Millipore | S-004-C | |
| RPMI-1640 | Lonza | 12-702-F | |
| Ficoll-paque plus | GE healthcare | 17-1440-02 |
References
- Dimitroff, C. J., Lechpammer, M., Long-Woodward, D., Kutok, J. L. Rolling of human bone-metastatic prostate tumor cells on human bone marrow endothelium under shear flow is mediated by E-selectin. Cancer Res. 64, 5261-5269 (2004).
- Barthel, S. R., Gavino, J. D., Descheny, L., Dimitroff, C. J. Targeting selectins and selectin ligands in inflammation and cancer. Expert Opin. Ther. Targets. 11, 1473-1491 (2007).
- Konstantopoulos, K., Thomas, S. N. Cancer cells in transit: the vascular interactions of tumor cells. Annu. Rev. Biomed. Eng. 11, 177-202 (2009).
- Nagrath, S., Sequist, L. V., Maheswaran, S., Bell, D. W., Irimia, D., Ulkus, L., et al. Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology. Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).
- Mannweiler, S., Amersdorfer, P., Trajanoski, S., Terrett, J. A., King, D., Mehes, G. Heterogeneity of prostate-specific membrane antigen (PSMA) expression in prostate carcinoma with distant metastasis. Pathol. Oncol. Res. 15 (2), 167-172 (2009).
- Tagawa, S. T., Milowsky, M. I., Morris, M. J., Vallabhajosula, S., Christos, P. J., Akhtar, N. H., et al. Phase II study of lutetium-177 labeled anti-prostate-specific membrane antigen (PSMA) monoclonal antibody J591 for metastatic castration-resistant prostate cancer. Cancer Res. , (2013).
- Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions. J. Vis. Exp. (66), 10-3791 (2012).
- Moss, M. A., Zimmer, S., Anderson, K. W. Role of metastatic potential in the adhesion of human breast cancer cells to endothelial monolayers. Anticancer Res. 20, 1425-1433 (2000).
- Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium. J Vis Exp. 24, (2009).
- Gebauer, F., Wicklein, D., Stubke, K., Nehmann, N., Schmidt, A., Salamon, J., et al. Selectin binding is essential for peritoneal carcinomatosis in a xenograft model of human pancreatic adenocarcinoma in pfp–/rag2– mice. Gut. 62 (5), 741-750 (2013).
- Giavazzi, R., Foppolo, M., Dossi, R., Remuzzi, A. Rolling and adhesion of human tumor cells on vascular endothelium under physiological flow conditions. J. Clin. Invest. 92 (6), 3038-3044 (1993).
- Remuzzi, A., Giavazzi, R., Dejana, E., Corada, M. Adhesion of tumor cells under flow. Adhesion Protein Protocols. 96, 153-157 (1999).
- Liu, H., Moy, P., Kim, S., Xia, Y., Rajasekaran, A., Navarro, V., et al. Monoclonal antibodies to the extracellular domain of prostate-specific membrane antigen also react with tumor vascular endothelium. Cancer Res. 57 (17), 3629-3634 (1997).
- Jung, B., Obinata, H., Galvani, S., Mendelson, K., Ding, B. S., Skoura, A., et al. Flow-regulated endothelial S1P receptor-1 signaling sustains vascular development. Dev. Cell. 23 (3), 600-610 (2012).
- Yin, X., Rana, K., Ponmudi, V., King, M. R. Knockdown of fucosyltransferase III disrupts the adhesion of circulating cancer cells to E-selectin without affecting hematopoietic cell adhesion. Carbohydr. Res. 345 (16), 2334-2342 (2010).
- Carman, C. V., Springer, T. A. A transmigratory cup in leukocyte diapedesis both through individual vascular endothelial cells and between them. J Cell Bio. 167 (2), 377-388 (2004).
