患者とヒト内皮細胞に由来する前立腺循環腫瘍細胞との間のE-セレクチン介在性の相互作用を観察するin vitro法での
Summary
我々の報告は、生理的流れの条件下で、前立腺癌においてCTC / ECの相互作用を可視化し、分析するためのユニークな方法を記載する。
Abstract
転移は血管外遊出および二ニッチを形成するためのアクセスを取得することにより、腫瘍細胞が原発腫瘍intravasate血液血管およびリンパ系から脱落するプロセスである。血管系からの腫瘍細胞の血管外遊出は、異なる細胞株から得られた内皮細胞（EC）および腫瘍細胞を用いて研究することができる。初期の研究は、静的条件を用いて行ったが、それはウェルのECは生理的流れの条件下では異なる挙動を示すことが実証されている。したがって、異なるフローチャンバアセンブリは、現在のECによる癌細胞の相互作用を研究するために使用されている。電流フローチャンバアセンブリは、異なる剪断応力条件下での異なる細胞株または流体のいずれかを使用して再現性のある結果を提供する。しかしながら、このような循環腫瘍細胞（CTCの）のような希少細胞との相互作用を観察し、研究するために、特定の変更は、従来のフローチャンバアセンブリに行われる必要がある。 CTCの血液細胞数百万人のうち、稀な細胞集団である。これにより、CTCの純粋な集団を得ることは困難である。通常の循環で見られる細胞の異なるタイプのCTCの汚染が存在濃縮または枯渇の技術を使用して避けられない。本報告では、蛍光ラベル、循環前立腺癌細胞に固有の方法を説明し、自己組織化フローチャンバーシステムにおいて、電気部品との相互作用を研究する。この技術はさらに、前立腺のCTCおよび関心対象の任意のタンパク質間の相互作用を観察するために適用することができる。
Introduction
転移は、ほとんど理解さままで複雑な多段階プロセスである。 E-selectin/selectinリガンド軸は、血管内皮細胞と癌細胞との間の1,2主要接着剤の相互作用を促進することによって腫瘍転移において重要な役割を果たすことが示されている。内皮細胞（E）-セレクチン異なるE-セレクチンリガンド（単数または複数）は、腫瘍細胞3で表されているが、活性化された内皮細胞によって発現される膜貫通タンパク質である。多数のインビトロのアプローチが成功裏に腫瘍細胞および内皮細胞（EC） は1〜E-selectin/selectinリガンド相互作用をモデル化するために使用されてきた。これらの相互作用を研究するために、異なるフローチャンバーシステムは、血管系をシミュレートするために使用されている。フローチャンバーアセンブリの中でも、電気部品と連動して平行プレートフローチャンバー（PPFC）が日常的にインビボせん断応力条件においてシミュレートインビトロモデルとして使用される。この中法のECは35-mmディッシュ上で増殖させ、単層を達成した後、電気部品は、PPFCに取り付けられており、せん断応力ベースの実験を行っている。
しかし、PPFC、その他の現在のシステムは、CTCのは、血液細胞の何百万人の間で循環して、原発腫瘍から脱落、細胞のまれな集団であるため、主に、患者とのECから派生（CTCの）循環腫瘍細胞の間の接着相互作用を研究するために多くの制約を提示（10 9血液細胞あたり1 CTC）4。従って、培養細胞株の無制限の供給とは異なり、低CTCカウントを再生分析のための相互作用を記録するために適切な流路幅を必要とする非常に少数のまれなCTCおよび/ EC相互作用をもたらす。患者派生のCTCが不純な集団であることからさらに、したがって、識別マーカーは、特定の内のCTCを追跡するために必要とされている。この問題を解決するために、我々は、前立腺癌（PCaの）CTを同定する新しい方法を開発Csの実質的にすべてのこれらのCTCのは、それらの細胞表面上で、5,6、前立腺特異的膜抗原（PSMA）を発現するという事実を利用することにより。本稿では、転移のメカニズムを理解するために、最終的には、ECの前立腺のCTCの相互作用を研究するために我々の新しいシステムの潜在的な有用性を実証するために、前立腺癌細胞株、MDA PCA2B（MDA）を使用しました。
私たちの方法論は、生体内血管系7-9 にシミュレートする様々なせん断基づく実験に適用することができます。 PCaのCTC / ECの相互作用を調べることに加えて、現在のフローチャンバーシステムを容易に電気部品で末梢血単核細胞または腫瘍細胞の相互作用を分析するように適合され得る。分解·フローチャンバーの再組み立ての容易さ、（以下、マイクロスライドという）マイクロスライドIII（0.1）は 、灌流の下で培養のECを可能にし、PRを誘導するために種々のサイトカインでのECを刺激otein式。加えて、培養された電気部品、例えば、E-およびP-セレクチン組換えタンパク質は、腫瘍細胞と相互作用し、マイクロスライド上に被覆することができる層流状態10で観察することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
による血液細胞の間でのCTCの数が少ないために、それは、細胞の純粋な集団としてのCTCを単離することは困難である。 CTC / ECの相互作用を研究するために、CTCの稀で、不純な人口は、2つの主要な課題提起：血液細胞の間でCTCのa）の特定を; B）CTC / ECの相互作用の観察。
血液細胞のう ち、前立腺のCTCを同定する第一の制限を克服するために、我?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、米国国立がん研究所から国防総省前立腺癌研究プログラム（W81XWH-12-1から0124）の、U54CA143876、ロバートMcCooey泌尿生殖器がん研究基金からの資金によってサポートされていました。私たちは、HUVECをを提供するためのVE-カドヘリン抗体を提供し、博士マルコSeandel（外科）博士Annaritaロレンツォ（病理部）に感謝したいと思います。
Materials
| Microslide | Ibidi | 80331 | |
| Fibronectin | Millipore | FC010 | |
| Plastic tubing | Tygon | AAQ04103 | |
| Male luer adapter | GlycoTech | 31-001 | |
| Female luer adapter | GlycoTech | 31-001 | |
| Syringe pump | Chemyx Inc | Fusion 100 | |
| Luer-lock syringe | BD Biosciences | 309628 | |
| M199 medium | Sigma | M7653 | |
| Endothelial Mitogen | Biomedical Technologies | BT-203 | |
| HBSS | Sigma | H9269 | |
| Anti-PSMA J591-488 | Weill Cornell Medical College-Lab of Urologic Oncology | ||
| Interleukin-1 beta | Peprotech | 200-01B | |
| Trypsin | Millipore | SM-2002-C | |
| Heparin | Sigma | H-3149 | |
| HUVECs | Weill Cornell Medical College-Department of Surgery | provided by Marco Seandel | |
| VE-Cadherin | Santa Cruz | sc-5648 | |
| 10x objective | Zeiss Plan Neofluar | ||
| Enzyme free cell dissociation reagent | Millipore | S-004-C | |
| RPMI-1640 | Lonza | 12-702-F | |
| Ficoll-paque plus | GE healthcare | 17-1440-02 |
References
- Dimitroff, C. J., Lechpammer, M., Long-Woodward, D., Kutok, J. L. Rolling of human bone-metastatic prostate tumor cells on human bone marrow endothelium under shear flow is mediated by E-selectin. Cancer Res. 64, 5261-5269 (2004).
- Barthel, S. R., Gavino, J. D., Descheny, L., Dimitroff, C. J. Targeting selectins and selectin ligands in inflammation and cancer. Expert Opin. Ther. Targets. 11, 1473-1491 (2007).
- Konstantopoulos, K., Thomas, S. N. Cancer cells in transit: the vascular interactions of tumor cells. Annu. Rev. Biomed. Eng. 11, 177-202 (2009).
- Nagrath, S., Sequist, L. V., Maheswaran, S., Bell, D. W., Irimia, D., Ulkus, L., et al. Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology. Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).
- Mannweiler, S., Amersdorfer, P., Trajanoski, S., Terrett, J. A., King, D., Mehes, G. Heterogeneity of prostate-specific membrane antigen (PSMA) expression in prostate carcinoma with distant metastasis. Pathol. Oncol. Res. 15 (2), 167-172 (2009).
- Tagawa, S. T., Milowsky, M. I., Morris, M. J., Vallabhajosula, S., Christos, P. J., Akhtar, N. H., et al. Phase II study of lutetium-177 labeled anti-prostate-specific membrane antigen (PSMA) monoclonal antibody J591 for metastatic castration-resistant prostate cancer. Cancer Res. , (2013).
- Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions. J. Vis. Exp. (66), 10-3791 (2012).
- Moss, M. A., Zimmer, S., Anderson, K. W. Role of metastatic potential in the adhesion of human breast cancer cells to endothelial monolayers. Anticancer Res. 20, 1425-1433 (2000).
- Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium. J Vis Exp. 24, (2009).
- Gebauer, F., Wicklein, D., Stubke, K., Nehmann, N., Schmidt, A., Salamon, J., et al. Selectin binding is essential for peritoneal carcinomatosis in a xenograft model of human pancreatic adenocarcinoma in pfp–/rag2– mice. Gut. 62 (5), 741-750 (2013).
- Giavazzi, R., Foppolo, M., Dossi, R., Remuzzi, A. Rolling and adhesion of human tumor cells on vascular endothelium under physiological flow conditions. J. Clin. Invest. 92 (6), 3038-3044 (1993).
- Remuzzi, A., Giavazzi, R., Dejana, E., Corada, M. Adhesion of tumor cells under flow. Adhesion Protein Protocols. 96, 153-157 (1999).
- Liu, H., Moy, P., Kim, S., Xia, Y., Rajasekaran, A., Navarro, V., et al. Monoclonal antibodies to the extracellular domain of prostate-specific membrane antigen also react with tumor vascular endothelium. Cancer Res. 57 (17), 3629-3634 (1997).
- Jung, B., Obinata, H., Galvani, S., Mendelson, K., Ding, B. S., Skoura, A., et al. Flow-regulated endothelial S1P receptor-1 signaling sustains vascular development. Dev. Cell. 23 (3), 600-610 (2012).
- Yin, X., Rana, K., Ponmudi, V., King, M. R. Knockdown of fucosyltransferase III disrupts the adhesion of circulating cancer cells to E-selectin without affecting hematopoietic cell adhesion. Carbohydr. Res. 345 (16), 2334-2342 (2010).
- Carman, C. V., Springer, T. A. A transmigratory cup in leukocyte diapedesis both through individual vascular endothelial cells and between them. J Cell Bio. 167 (2), 377-388 (2004).
