Nuestro informe se describe un método único para visualizar y analizar las interacciones CTC / CE en el cáncer de próstata en condiciones de flujo fisiológico.
La metástasis es un proceso en el que las células tumorales se desprenden de tumor intravasate vascular de la sangre primaria y el sistema linfático, de ese modo, obtener el acceso a la extravasación y formar un nicho secundaria. La extravasación de las células tumorales desde el sistema vascular de la sangre puede ser estudiada usando células endoteliales (ECs) y las células tumorales obtenidas a partir de diferentes líneas celulares. Se llevaron a cabo estudios iniciales usando condiciones estáticas, pero se ha documentado bien que los EC se comportan de manera diferente bajo condiciones de flujo fisiológico. Por lo tanto, los diferentes conjuntos de cámara de flujo actualmente se utilizan para el estudio de las interacciones celulares de cáncer con EC. Ensambles de cámara de flujo actuales ofrecen resultados reproducibles, ya sea utilizando diferentes líneas celulares o de líquido a diferentes condiciones de estrés de cizalla. Sin embargo, para observar y estudiar las interacciones con las células raras, como las células del tumor (CTCs) en circulación, se requieren ciertos cambios que deben introducirse en el conjunto de la cámara de flujo convencional. CTCsson una población de células raras entre millones de células sanguíneas. En consecuencia, es difícil obtener una población pura de CTC. La contaminación de las CTC con diferentes tipos de células que se encuentran normalmente en la circulación es inevitable el uso de presente de enriquecimiento o técnicas de agotamiento. En el presente informe se describe un método único para la etiqueta circular las células de cáncer de próstata con fluorescencia y estudiar sus interacciones con EC en un sistema de cámara de flujo auto-ensamblado. Esta técnica se puede aplicar además a observar las interacciones entre CTC próstata y cualquier proteína de interés.
La metástasis es un proceso de múltiples pasos compleja que sigue siendo poco conocida. El eje ligando E-selectin/selectin se ha demostrado que desempeñan un papel importante en la metástasis tumoral mediante la promoción de interacciones adhesivas primarias entre el endotelio vascular y células de cáncer de 1,2. Endotelial (E)-selectina es una proteína transmembrana expresada por las células endoteliales activadas, mientras diferente ligando (s) de E-selectina se expresan por las células tumorales 3. Numerosos enfoques in vitro se han empleado con éxito para modelar las interacciones de ligando E-selectin/selectin entre las células tumorales y las células endoteliales (EC) 1. Para el estudio de estas interacciones, se están empleando diferentes sistemas de cámara de flujo para simular el sistema vascular arterial. Entre conjuntos de cámara de flujo, la cámara de flujo de placas paralelas (PPFC) en conjunción con las EC se utiliza rutinariamente como un modelo in vitro simulando in vivo en condiciones de estrés de cizallamiento. En estemétodo, ECs se cultivan en un plato de 35 mm y después de la consecución de una monocapa, las EC se adjuntan a la PPFC y experimentos basados en la tensión de cizallamiento se realizan.
Sin embargo, PPFC y otros sistemas actuales presentan muchas limitaciones para el estudio de las interacciones adhesivas entre las células tumorales (CTC) derivadas de pacientes y EC, que circula principalmente, porque CTC son una población rara de células, arrojar desde el tumor primario, que circula entre los millones de células de la sangre (1 CTC por 10 9 células de la sangre) 4. Por lo tanto, a diferencia de suministro ilimitado de líneas de células cultivadas, bajo recuento de CTC conducen a muy pocas y raras interacciones CTC / CE, requiriendo adecuado ancho de canal de flujo para registrar las interacciones de análisis de la reproducción. Además, dado que los pacientes CTC derivados son una población impura, por lo tanto, se requiere un marcador de identificación para rastrear las CTC en específico. Para solucionar este problema, hemos desarrollado un nuevo método para identificar el cáncer de próstata (CaP) CTCs tomando ventaja del hecho de que prácticamente todos estos CTC expresan antígeno prostático específico de membrana (PSMA) en su superficie celular 5,6. En este informe, se utilizó la línea celular de cáncer de próstata, MDA PCa2b (MDA), para demostrar la utilidad potencial de nuestro nuevo sistema para el estudio de la próstata interacciones CTC con EC, con el tiempo para comprender el mecanismo de la metástasis.
Nuestra metodología se puede aplicar para varios experimentos de cizalla basada en la simulación de sistema vascular in vivo en 7-9. Además de examinar las interacciones CaP CTC / CE, el sistema de cámara de flujo de corriente podría adaptarse fácilmente para el análisis de células mononucleares de sangre periférica o de las interacciones de células tumorales con EC. La facilidad de montaje y desmontaje de la cámara de flujo, un microportaobjetos III (0,1) (en lo sucesivo denominada como microportaobjetos), permite el cultivo de EC bajo perfusión y la estimulación de los EC con diferentes citocinas para inducir prOtein expresión. Además, cultivos de ECS, proteínas recombinantes, tales como E-y P-selectina se pueden cubrir en el microportaobjetos y las interacciones con las células tumorales pueden ser observados bajo condiciones de flujo laminar 10.
Debido al bajo número de CTC entre las células de la sangre, es difícil aislar los CTC como una población pura de células. Con el fin de estudiar las interacciones CTC / CE, la población rara e impuro de los CTC plantea dos grandes retos: a) Identificación de los CTC entre las células de la sangre; b) Observación de las interacciones CTC / CE.
Para superar la primera limitación de la identificación de los CTC de próstata entre los glóbulos, tomamos ve…
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por fondos del Departamento de Defensa de la próstata Programa de Investigación del Cáncer (W81XWH-12-1-0124), U54CA143876 del Instituto Nacional del Cáncer y el Fondo de Investigación Robert McCooey Oncología Genitourinaria. Nos gustaría dar las gracias al Dr. Annarita Lorenzo (Departamento de Patología) para proporcionar anticuerpos VE-cadherina, y el Dr. Marco Seandel (Departamento de Cirugía) para proporcionar HUVECs.
Microslide | Ibidi | 80331 | |
Fibronectin | Millipore | FC010 | |
Plastic tubing | Tygon | AAQ04103 | |
Male luer adapter | GlycoTech | 31-001 | |
Female luer adapter | GlycoTech | 31-001 | |
Syringe pump | Chemyx Inc | Fusion 100 | |
Luer-lock syringe | BD Biosciences | 309628 | |
M199 medium | Sigma | M7653 | |
Endothelial Mitogen | Biomedical Technologies | BT-203 | |
HBSS | Sigma | H9269 | |
Anti-PSMA J591-488 | Weill Cornell Medical College-Lab of Urologic Oncology | ||
Interleukin-1 beta | Peprotech | 200-01B | |
Trypsin | Millipore | SM-2002-C | |
Heparin | Sigma | H-3149 | |
HUVECs | Weill Cornell Medical College-Department of Surgery | provided by Marco Seandel | |
VE-Cadherin | Santa Cruz | sc-5648 | |
10x objective | Zeiss Plan Neofluar | ||
Enzyme free cell dissociation reagent | Millipore | S-004-C | |
RPMI-1640 | Lonza | 12-702-F | |
Ficoll-paque plus | GE healthcare | 17-1440-02 |