Vår rapport beskriver en unik metod för att visualisera och analysera CTC / EC interaktioner i prostatacancer under fysiologiska flödesförhållanden.
Metastas är en process vid vilken tumörceller skjul från den primära tumören intravasate blod vaskulära och lymfatiska systemet, varigenom, att få tillgång till extravasera och bildar en sekundär nisch. Kan studeras extravasation av tumörceller från blodet kärlsystemet med användning av endotelceller (ECS) och tumörceller erhållna från olika cellinjer. Initiala studier genomfördes med hjälp av statiska förhållanden, men det är väl dokumenterat att EC beter sig annorlunda under fysiologiska flödesförhållanden. Därför används olika flödeskammarpatroner som för närvarande används för att studera cancercellsinteraktioner med ECS. Nuvarande flöde kammar församlingar erbjuder reproducerbara resultat med hjälp av antingen olika cellinjer eller vätska vid olika skjuvning spänningsförhållanden. Men för att observera och studera interaktioner med sällsynta celler såsom cirkulerande tumörceller (CTCs) är vissa ändringar som behövs för att framställas med den konventionella flödeskammarenheten. CTCsär en sällsynt cellpopulation bland miljontals blodkroppar. Följaktligen är det svårt att erhålla en ren population av CTCs. Förorening av CTCs med olika typer av celler som normalt finns i cirkulationen är oundvikligt att använda nuvarande anrikning eller utarmning tekniker. I denna rapport beskriver vi en unik metod för att fluorescerande etikett cirkulerande prostatacancerceller och studera deras interaktioner med EC i en själv monterat flödeskammarsystem. Denna teknik kan tillämpas vidare att observera samspelet mellan prostata CTCs och något protein av intresse.
Metastas är en komplex process i flera steg som förblir dåligt förstådda. Den E-selectin/selectin ligand-axeln har visat sig spela en viktig roll vid tumörmetastaser genom att främja primära adhesiva interaktioner mellan det vaskulära endotelet och cancerceller 1,2. Endothelial (E)-selektin är ett transmembrant protein som uttrycks av aktiverade endotelceller, medan olika E-selektin-ligand (er) uttrycks av tumörceller 3. Ett flertal in vitro-metoder har framgångsrikt använts för att modellera E-selectin/selectin ligand interaktioner mellan tumörceller och endotelceller (ECS) 1. För att studera dessa interaktioner är olika flödeskammarsystem som tillämpas för att simulera blod kärlsystemet. Bland flödeskammarpatroner, är parallella plattor flödeskammaren (PPFC) jämförd med ECS användes rutinmässigt som en in vitro-modell som simulerar in vivo skjuvspänning betingelser. I dettametod, EC odlas på en 35-mm skålen och efter att åstadkomma ett monolager, är EC bifogas PPFC och skjuvspänningen baserade experiment utförs.
Men PPFC och andra aktuella system presentera många begränsningar att studera självhäftande interaktioner mellan cirkulerande tumörceller (CTCs) härrör från patienter och EC, i första hand, eftersom CTCs är en sällsynt population av celler, skjul från den primära tumören, som cirkulerar bland miljontals blodceller (1 CTC per 10 9 blodkroppar) 4. Därför, till skillnad obegränsat utbud av odlade cellinjer, låg CTC räknar leder till mycket få och sällsynta CTC / EG-interaktioner, som kräver korrekt flöde kanalbredd för att registrera interaktioner för uppspelning analys. Dessutom, eftersom patienten härledda CTCs är en oren befolkningen, alltså en identifikationsmarkör krävs för att spåra CTCs i specifika. För att lösa detta problem har vi utvecklat en ny metod för att identifiera prostatacancer (PCA) CTCs, genom att ta fördel av det faktum att praktiskt taget alla dessa CTCs uttrycka prostataspecifikt membranantigen (PSMA) på sin cellyta 5,6. I denna rapport har vi använt prostatacancer cellinje, MDA PCa2b (MDA), för att visa potentialen nyttan av vårt nya system för att studera prostata CTC interaktioner med EC, så småningom att förstå mekanismen av metastaser.
Vår metod kan tillämpas för olika skjuvning baserade experiment som simulerar in vivo-kärlsystemet 7-9. Förutom att undersöka PCa CTC / EC interaktioner, kan strömflödet kammarsystemet enkelt anpassas för analys av perifera mononukleära blodceller eller tumörcellernas interaktioner med EC. Lättheten att demontering och återmontering av flödet kammaren, en Micro III (0,1) (nedan kallat Micro), tillåter odling EC i perfusion och stimulerande EC med olika cytokiner att framkalla protein uttryck. Dessutom odlade EC, rekombinanta proteiner som E-och P-selektin kan beläggas på mikros och interaktion med tumörceller kan observeras under laminära flödesförhållanden 10.
På grund av det låga antalet CTCs bland blodceller, är det svårt att isolera CTCs som en ren population av celler. För att studera CTC / EC interaktioner, den sällsynta och orena befolkning CTCs medför två stora utmaningar: a) Identifiering av CTCs bland blodceller; b) Observation av CTC / EG-interaktioner.
För att övervinna den första begränsningen att identifiera prostata CTCs bland blodkroppar, tog vi fördel av det faktum att nästan alla prostatat…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av medel från Department of Defense-Prostate Cancer Research Program (W81XWH-12-1-0124), U54CA143876 från National Cancer Institute, och Robert McCooey Genitourinary Oncology Research Fund. Vi vill tacka Dr Annarita Lorenzo (Institutionen för patologi) för att tillhandahålla VE-cadherin-antikroppar, och Dr Marco Seandel (Institutionen för kirurgi) för att ge HUVECs.
Microslide | Ibidi | 80331 | |
Fibronectin | Millipore | FC010 | |
Plastic tubing | Tygon | AAQ04103 | |
Male luer adapter | GlycoTech | 31-001 | |
Female luer adapter | GlycoTech | 31-001 | |
Syringe pump | Chemyx Inc | Fusion 100 | |
Luer-lock syringe | BD Biosciences | 309628 | |
M199 medium | Sigma | M7653 | |
Endothelial Mitogen | Biomedical Technologies | BT-203 | |
HBSS | Sigma | H9269 | |
Anti-PSMA J591-488 | Weill Cornell Medical College-Lab of Urologic Oncology | ||
Interleukin-1 beta | Peprotech | 200-01B | |
Trypsin | Millipore | SM-2002-C | |
Heparin | Sigma | H-3149 | |
HUVECs | Weill Cornell Medical College-Department of Surgery | provided by Marco Seandel | |
VE-Cadherin | Santa Cruz | sc-5648 | |
10x objective | Zeiss Plan Neofluar | ||
Enzyme free cell dissociation reagent | Millipore | S-004-C | |
RPMI-1640 | Lonza | 12-702-F | |
Ficoll-paque plus | GE healthcare | 17-1440-02 |