Método in vitro para observar interacciones mediadas por E-selectina Entre próstata células tumorales circulantes derivadas de pacientes y las células endoteliales humanas

Summary

Nuestro informe se describe un método único para visualizar y analizar las interacciones CTC / CE en el cáncer de próstata en condiciones de flujo fisiológico.

Abstract

La metástasis es un proceso en el que las células tumorales se desprenden de tumor intravasate vascular de la sangre primaria y el sistema linfático, de ese modo, obtener el acceso a la extravasación y formar un nicho secundaria. La extravasación de las células tumorales desde el sistema vascular de la sangre puede ser estudiada usando células endoteliales (ECs) y las células tumorales obtenidas a partir de diferentes líneas celulares. Se llevaron a cabo estudios iniciales usando condiciones estáticas, pero se ha documentado bien que los EC se comportan de manera diferente bajo condiciones de flujo fisiológico. Por lo tanto, los diferentes conjuntos de cámara de flujo actualmente se utilizan para el estudio de las interacciones celulares de cáncer con EC. Ensambles de cámara de flujo actuales ofrecen resultados reproducibles, ya sea utilizando diferentes líneas celulares o de líquido a diferentes condiciones de estrés de cizalla. Sin embargo, para observar y estudiar las interacciones con las células raras, como las células del tumor (CTCs) en circulación, se requieren ciertos cambios que deben introducirse en el conjunto de la cámara de flujo convencional. CTCsson una población de células raras entre millones de células sanguíneas. En consecuencia, es difícil obtener una población pura de CTC. La contaminación de las CTC con diferentes tipos de células que se encuentran normalmente en la circulación es inevitable el uso de presente de enriquecimiento o técnicas de agotamiento. En el presente informe se describe un método único para la etiqueta circular las células de cáncer de próstata con fluorescencia y estudiar sus interacciones con EC en un sistema de cámara de flujo auto-ensamblado. Esta técnica se puede aplicar además a observar las interacciones entre CTC próstata y cualquier proteína de interés.

Introduction

La metástasis es un proceso de múltiples pasos compleja que sigue siendo poco conocida. El eje ligando E-selectin/selectin se ha demostrado que desempeñan un papel importante en la metástasis tumoral mediante la promoción de interacciones adhesivas primarias entre el endotelio vascular y células de cáncer de ^1,2. Endotelial (E)-selectina es una proteína transmembrana expresada por las células endoteliales activadas, mientras diferente ligando (s) de E-selectina se expresan por las células tumorales ^3. Numerosos enfoques in vitro se han empleado con éxito para modelar las interacciones de ligando E-selectin/selectin entre las células tumorales y las células endoteliales (EC) ^1. Para el estudio de estas interacciones, se están empleando diferentes sistemas de cámara de flujo para simular el sistema vascular arterial. Entre conjuntos de cámara de flujo, la cámara de flujo de placas paralelas (PPFC) en conjunción con las EC se utiliza rutinariamente como un modelo in vitro simulando in vivo en condiciones de estrés de cizallamiento. En estemétodo, ECs se cultivan en un plato de 35 mm y después de la consecución de una monocapa, las EC se adjuntan a la PPFC y experimentos basados ​​en la tensión de cizallamiento se realizan.

Sin embargo, PPFC y otros sistemas actuales presentan muchas limitaciones para el estudio de las interacciones adhesivas entre las células tumorales (CTC) derivadas de pacientes y EC, que circula principalmente, porque CTC son una población rara de células, arrojar desde el tumor primario, que circula entre los millones de células de la sangre (1 CTC por 10 ⁹ células de la sangre) ^4. Por lo tanto, a diferencia de suministro ilimitado de líneas de células cultivadas, bajo recuento de CTC conducen a muy pocas y raras interacciones CTC / CE, requiriendo adecuado ancho de canal de flujo para registrar las interacciones de análisis de la reproducción. Además, dado que los pacientes CTC derivados son una población impura, por lo tanto, se requiere un marcador de identificación para rastrear las CTC en específico. Para solucionar este problema, hemos desarrollado un nuevo método para identificar el cáncer de próstata (CaP) CTCs tomando ventaja del hecho de que prácticamente todos estos CTC expresan antígeno prostático específico de membrana (PSMA) en su superficie celular ^5,6. En este informe, se utilizó la línea celular de cáncer de próstata, MDA PCa2b (MDA), para demostrar la utilidad potencial de nuestro nuevo sistema para el estudio de la próstata interacciones CTC con EC, con el tiempo para comprender el mecanismo de la metástasis.

Nuestra metodología se puede aplicar para varios experimentos de cizalla basada en la simulación de sistema vascular in vivo en ^7-9. Además de examinar las interacciones CaP CTC / CE, el sistema de cámara de flujo de corriente podría adaptarse fácilmente para el análisis de células mononucleares de sangre periférica o de las interacciones de células tumorales con EC. La facilidad de montaje y desmontaje de la cámara de flujo, un microportaobjetos III ^(0,1) (en lo sucesivo denominada como microportaobjetos), permite el cultivo de EC bajo perfusión y la estimulación de los EC con diferentes citocinas para inducir prOtein expresión. Además, cultivos de ECS, proteínas recombinantes, tales como E-y P-selectina se pueden cubrir en el microportaobjetos y las interacciones con las células tumorales pueden ser observados bajo condiciones de flujo laminar ^10.

Protocol

1. El cultivo de HUVEC microportaobjetos para Interacciones de Observación del CTC-endoteliales Bajo la campana de cultivo de tejidos, primero enjuague el microportaobjetos, ancho de canal de 1 mm con PBS. Suavemente la capa MicroSlide con 200 l de 50 mg / ml de fibronectina (disuelto en PBS) usando una jeringa de cierre Luer de 1 ml. Cubrir el MicroSlide con la tapa y mantenerlo dentro de la campana de cultivo de tejido durante 30 min. De dispensación lenta del líquido en el MicroSlide impide la…

Representative Results

La figura 1 muestra un cultivo O / N de una monocapa de EC en la MicroSlide. Los batiduras en la Figura 1A muestra que el 100% de la MicroSlide es visible usando objetivo 5X mientras que el 70% es visible utilizando un objetivo de 10 aumentos (figura 1B). Para E-selectina mediada por las interacciones, las células de rodadura en los bordes no se consideran que hace más de 70% de la MicroSlide disponible para la grabación en vídeo y análisis de la reproducción. En …

Discussion

Debido al bajo número de CTC entre las células de la sangre, es difícil aislar los CTC como una población pura de células. Con el fin de estudiar las interacciones CTC / CE, la población rara e impuro de los CTC plantea dos grandes retos: a) Identificación de los CTC entre las células de la sangre; b) Observación de las interacciones CTC / CE.

Para superar la primera limitación de la identificación de los CTC de próstata entre los glóbulos, tomamos ve…

Materials

Microslide	Ibidi	80331
Fibronectin	Millipore	FC010
Plastic tubing	Tygon	AAQ04103
Male luer adapter	GlycoTech	31-001
Female luer adapter	GlycoTech	31-001
Syringe pump	Chemyx Inc	Fusion 100
Luer-lock syringe	BD Biosciences	309628
M199 medium	Sigma	M7653
Endothelial Mitogen	Biomedical Technologies	BT-203
HBSS	Sigma	H9269
Anti-PSMA J591-488	Weill Cornell Medical College-Lab of Urologic Oncology
Interleukin-1 beta	Peprotech	200-01B
Trypsin	Millipore	SM-2002-C
Heparin	Sigma	H-3149
HUVECs	Weill Cornell Medical College-Department of Surgery		provided by Marco Seandel
VE-Cadherin	Santa Cruz	sc-5648
10x objective	Zeiss Plan Neofluar
Enzyme free cell dissociation reagent	Millipore	S-004-C
RPMI-1640	Lonza	12-702-F
Ficoll-paque plus	GE healthcare	17-1440-02