Spatiotemporal information about dynamic proteins inside live cells is crucial for understanding biology. A type of super-resolution microscopy called fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM) reveals unique information about the cytokinetic Z ring in bacteria: both its bead-like appearance and the rapid dynamics of FtsZ within the ring.
Beeldvorming van biologische monsters met behulp van fluorescentie microscopie is aanzienlijk gevorderd met nieuwe technologieën om de resolutie barrière van de diffractie van het licht waardoor super-resolutie van de live samples te overwinnen. Er zijn drie hoofdtypen van super-resolutie technieken – gestimuleerde emissie uitputting (STED), single-molecule lokalisatie microscopie (met inbegrip van technieken zoals PALM, STORM, en GDSIM), en gestructureerde verlichting microscopie (SIM). Terwijl STED en single-molecule lokalisatie technieken tonen de grootste stijgingen in de resolutie, zijn ze langzamer geweest om grotere snelheden beeldverwerving bieden. Driedimensionale SIM (3D-SIM) is een wide-field fluorescentie microscopie techniek die een aantal voordelen ten opzichte van zowel enkele molecule lokalisatie en STED biedt. De resolutie wordt verbeterd, met typische laterale en axiale resoluties van 110 en 280 nm, respectievelijk monsternemingsdiepte tot 30 urn van het dekglaasje, waardoorbeeldvorming van gehele cellen. Recente ontwikkelingen (snel 3D-SIM) in de technologie verhogen de opnamesnelheid van rauwe beelden zorgt voor een snelle vangst van biologische processen die zich in seconden, terwijl de foto-toxiciteit en fotobleking aanzienlijk te verminderen. Hier beschrijven we het gebruik van een dergelijke werkwijze voor het bacteriële cellen die de fluorescentie-gemerkte cytokinetic FtsZ eiwit aan hoe cellen geanalyseerd en het soort unieke informatie dat deze techniek kan verschaffen.
Een aantal verschillende beeldvormende technieken zijn gebruikt in de jaren bacteriën, waaronder diverse elektronische en optische microscopie technieken te bestuderen. Terwijl elektronenmicroscopie biedt zeer hoge resolutie, tot de nanometer, de noodzaak van een vacuüm en het gebruik van contrastmiddelen heeft deze techniek om vaste en ingebedde monsters beperkt. Artefacten kunnen ook worden geïntroduceerd door langdurige monstervoorbereiding en een vakman nodig om de monsters te bereiden, en de beelden te analyseren en te interpreteren. Optische microscopie biedt de voordelen van een eenvoudigere monstervoorbereiding en de toepassing van meerdere labels met relatief gemak in vergelijking met elektronenmicroscopie. Met fluorescerende eiwitten en kleurstof conjugaten, de mogelijkheid om levende cellen te bestuderen met fluorescentie microscopie is ook mogelijk. Met verbeteringen in stabiliteit en fluorescerende fluorofoor eiwitgrootte / die leidt tot celtoxiciteit, alsmede vooruitgang afgenomen cameradetectie technologie, fluorescentie microscopie met behulp van wide-field en confocale beeldvormende systemen is aanzienlijk uitgebreid onze kennis van de ruimtelijke dynamiek van cellen. Met behulp van deze technieken, is onze kennis van de bacteriële cel in de afgelopen 20 jaar sterk ontwikkeld tot een veel meer gedetailleerde weergave die een hoge mate van structurele en eiwit organisatie binnen de bacteriële cel 1 openbaart.
Echter, conventionele werkwijzen optische microscopie diffractie beperkt, waardoor de inherente resolutie is ongeveer de helft van de golflengte van het excitatielicht worden gebruikt. Zelfs met de meest optimale conventionele optische microscopie systeem de beste laterale resolutie is ongeveer 220-250 nm en de axiale resolutie is ongeveer 500 nm (zie voor Schermelleh et al. 2). Voor bacteriële cel biologen in het bijzonder, dit nog steeds ernstig ons begrip van de ruimtelijke organisatie van deze kleine cellen beperkt; het zijn slechts 1-2 micrometer in diametereter en 1-10 micrometer in lengte. Er is ook behoefte aan hogere resolutie technieken die kunnen worden uitgevoerd op levende cellen waarin dynamisch ruimtelijk gedrag van een eiwit kan worden geanalyseerd om te vullen in vitro data.
In de afgelopen tien jaar hebben een aantal super-resolutie fluorescentie imaging technieken ontwikkeld. Super-resolutie microscopie beschrijft beeldvormende technieken die ten minste het dubbele van de laterale resolutie verkrijgbaar met conventionele lichtmicroscopie, waardoor het diffractie barrière overwinnen. Deze technieken manipuleren verlichting en / of analyse van het uitgestraalde licht werkelijke toename in de schijnbare resolutie maken. Er zijn drie hoofdtypen van super-resolutie technieken – i) gestimuleerde emissie uitputting microscopie 3 (STED); ii) single-molecule lokalisatie microscopie, met inbegrip van technieken zoals fotoactivatie lokalisatie microscopie 4,5 (PALM), stochastische optische reconstructie microscopie <sup> 6 (STORM), directe STORM 7 (dSTORM), en de grondtoestand uitputting met individuele molecuul terugkeer 8 (GDSIM); en iii) gestructureerde verlichting microscopie 9-12 (SIM). Single-molecule lokalisatie technieken bieden de grootste stijgingen in laterale resolutie, tot tussen de 10-40 nm in biologische monsters. In veel implementaties van single molecule lokalisatie microscopie wordt monsternemingsdiepte beperkt tot de uitdovende golf en de eerste implementaties van STED zijn ook beperkt in de bemonsteringsdiepte. De recente ontwikkelingen zoals het gebruik van adaptieve optiek exploitatie van astigmatisme in de functie punt verspreiden op verschillende brandpunten, multi-plane detectie en middels twee doelen de axiale positie van het uitgezonden licht afleiden gezien verbeteringen in zowel de axiale diepten resolutie en sampling in zowel STED en single molecule lokalisatie 13,14. Data-acquisitie tarieven voor STED en single-molecule lokalisatietechniekenzijn ook relatief traag vanwege het grote aantal beelden die moeten worden verworven voor de maximale resolutie (tot 50.000 voor lokalisatie technieken). Deze langzame data acquisitie leent zich niet voor de beeldvorming van levende monsters zonder aangepaste modificaties dat vaak vrij duur. Deze twee technieken zijn momenteel optimaal geschikt voor vaste monsters (voor een overzicht zie 2,15), echter veel werk wordt gedaan om deze beperking te pakken.
Drie dimensionale gestructureerde verlichting microscopie (3D-SIM) is een wide-field techniek die zowel laterale en axiale resolutie resulteert in een resolutie van ongeveer 110 en 280 nm, respectievelijk verbetert. Monsternemingsdiepte tot 30 urn van het dekglaasje, waardoor beeldvorming van gehele cellen. De variatie van de 3D-SIM ontwikkeld door Sedat, Agard, en Gustaffsson op de optische microscoop eXperimental (OMX) platform gaat de verlichting van het monster met een bekend patroon raster dat in 15 verschillende bewogen wordtposities in elke zvliegtuig 9-11. De franjes in de resulterende moirépatronen die zijn gemaakt in de frequentie ruimte buiten het waarneembare gebied worden gemeten. De informatie van de frequentieruimte is computationeel gereconstrueerd tot een zichtbaar beeld super-resolution 10,11 genereren. De relatieve snelheid waarmee de onbewerkte beelden kunnen worden verkregen met deze techniek maakt beeldvorming van levende cellen. Het is echter belangrijk op te merken dat voor de biologische processen die zich op een tijdschaal van seconden, de overname koers van de ruwe beelden is nog steeds te langzaam om dynamische veranderingen vast te leggen. Voor de tijd-serie met een opnamesnelheid van seconden, kan de herhaalde aankoop zonder voldoende hersteltijd leiden tot fototoxiciteit en fotobleking, vooral tijdens live-beeldvorming van kleine bacteriële cellen.
Om deze problemen te overwinnen, hebben recente ontwikkelingen voor snel 3D-SIM (F3D-SIM) ontwikkeld. Hier beschrijven we een zogenaamde OMX Blaze 16 dat ik wasntroduced eind 2011 Deze technologie maakt het patroon belichting zonder het gebruik van fysieke raster gebruikt als bij eerdere systemen. Het gebruik van storende lichtstralen en nieuwe shutter technologie zorgt voor de creatie van het patroon het licht op het monster in een zeer snelle manier. De snelheid van beeldopname werd verder verbeterd met de introductie van wetenschappelijke complementaire metaaloxide halfgeleider (scmos) camera's, vooral in vergelijking met de bestaande EMCCD camera. Deze veranderingen resulteerden in een mogelijke beeld acquisitie snelheid van een beeld per seconde voor een bemonstering diepte van 1 micrometer (512 x 512 pixels, 9 z-schijfjes), waardoor controle van dynamische veranderingen in cellen die zich voordoen binnen enkele seconden 16. De daling van de schijnbare belichting (excitatie) maal levende cellen met deze methode maakt ook langere tijdreeks worden gevangen of een verhoging van de opnamesnelheid.
De toepassing van F3D-SIM microscopie Hier beschrijven wij examine de structuur en de dynamische beweging van de cytokinetic Z ring in de cellen twee bacteriesoorten: het staafvormige model organisme Bacillus subtilis en coccoïde menselijk pathogeen Staphylococcus aureus. FtsZ is een tubuline-achtige cytoskelet eiwit dat een belangrijke rol bij de celdeling in bacteriën 17,18 speelt. Lokaliseert de verdeling plaats tenminste 20 andere verdeling eiwitten werven, die de verdeling inrichting 17,18 en wordt beschouwd als de kracht voor cel vernauwing 19-23 verschaffen. Deze methode blijkt dat FtsZ ongelijkmatig verdeeld rond de Z ring in beide organismen in een korrel-achtige regeling; oplossen van de lang gekoesterde vraag of de Z ring een continue uniforme riem rond de cel, zoals gevisualiseerd door conventionele wide-field fluorescentiemicroscopie of een discontinue structuur zoals voorgesteld door cryo-electron tomografie (ECT) 24. We zien hoe het vermogen van 3D-SIM sterk kunnen verbeteren ruimtelijke onderzoek klein (1micrometer diameter) ronde cellen zoals S. aureus die verdelen in drie opeenvolgende loodrechte vlakken (x, y, z). Time-lapse studies deze technieken blijkt dat de structuur van de Z-ring is dynamisch, met bruto organisatie veranderingen in de ring, in plaats FtsZ moleculen in en uit een vaste steiger 24.
Fluorescente live-cell imaging is een krachtig hulpmiddel dat de observatie van de dynamische veranderingen in de cellen na verloop van tijd mogelijk maakt. Levende beeldvorming van bacteriële celbiologie is uitdagend vanwege de kleine celgrootte en verminderd vermogen van de bacteriecellen op herhaalde blootstelling aan excitatielicht weerstaan. F3D-SIM heeft de tools die beschikbaar zijn voor alle celbiologie ondervragen uitgebreid, maar is het noodzakelijk om zorgvuldig uit te voeren deze techniek als artefacten kunnen worden ingevoerd als slecht geïmplementeerd. Er zijn een aantal belangrijke overwegingen voor het succesvolle gebruik van deze techniek. Omdat het een wide-field fluorescentie imaging methode die berust op het gebruik van de puntspreidingsfunctie van het uitgestraalde licht, brekingsindex mismatch en sferische aberratie van het uitgezonden licht moet worden vermeden om accurate beeldreconstructie inschakelen. Het gebruik van dekglaasjes van 0,17 mm dikte een hoge kwaliteit variatie van signaalintensiteit voorkomen door glasdikte variabiliteit in de dekkinglip wordt sterk aanbevolen. Het is uiterst belangrijk om de sferische afwijking van het uitgestraalde licht zorgvuldig beoordelen tijdens de eerste stadia van alle experimenten en pas de immersie olie brekingsindex indien nodig. Dit kan variëren van dag tot dag als het afhankelijk is van zowel de temperatuur als de fixeermiddelen / substraat van het monster. Het gebruik van de onjuiste olie leidt tot inferieure reconstructie van de beelden met artefacten zoals halo en echosignalen.
Aan het einde van het beeldreconstructie proces voor elke fase een maat voor de kwaliteit van de reconstructie kan worden verkregen door de "best fit Ko angle" voor elke fase / hoek van de verlichting. Als deze waarde onder 1 voor elke hoek dan de kwaliteit van de gereconstrueerde zal zeer waarschijnlijk hoog. Als deze waarde dan 6, is het waarschijnlijk dat het gereconstrueerde beeld artefacten bevatten. Voorkomende artefacten omvatten i) het verschijnen van strepen in het beeld dat overeenkomteen van de hoeken van het raster. Dit kan het gevolg zijn van lagere signaal van dat rooster hoek; ii) haloing rond structuren. Dit kan van zeer ongelijke niveaus van signaal van heldere structuren vergeleken met omringende elementen een mismatch van de brekingsindex van de olie en het monster of kan het gevolg zijn van de structuur van het beeld al te amorfe en bevatten weinig "structuur" te erkend door het algoritme; iii) "grindnesten 'ten gevolge van een lage signaal-ruisverhouding in het beeld, gewoonlijk door hoge achtergrondsignaal; iv) structuren die zijn uitgerekt / langwerpige in xy waarin gevolg kan zijn brekingsindex mismatch olie en sample. Dit artefact is moeilijk te onderscheiden van een onervaren gebruiker. Het wordt aanbevolen om nieuwe gebruikers te raadplegen een ervaren SIM-onderzoeker voor advies over image interpretatie en analyse bij het starten van deze techniek te gebruiken.
Zoals met alle fluorescente live-cell imaging experimenten, het is important zorgvuldig evenwicht de excitatie energietoevoer teneinde de mate van fotobleken en fototoxiciteit van de cellen met voldoende emissiesignaal nodig om beelden te reconstrueren met minimale artefact minimaliseren. Overmatige fotobleken (meer dan 30% in een enkele z-stack overname) zal leiden tot een striping patroon in het gereconstrueerde beeld. Met het gebruik van scmos camera's, kan super-resolutie beelden met succes worden gereconstrueerd op basis van RAW-afbeeldingen met emissie-signaal zo laag als 1.000 tellingen boven de achtergrond. Dit kan zorgen voor zeer korte belichtingstijden waardoor photobleaching verminderen en het mogelijk maken snel vastleggen voor elk frame. Het verhoogt ook de hoeveelheid tijd tussen de frames voor cellen om te herstellen van de excitatie energietoevoer. Bovendien, aangezien de opnametijd voor elke lijst zeer kort kan zijn, de mate artefacten geïntroduceerd door "motion blur" tijdens een individueel opname wordt gereduceerd met gebruik van deze methode.
Deze variatie van 3D-SIM biedt een aantal andere voordelen ten opzichte van andere beschikbare super en hoge-resolutie imaging technologieën voor live-imaging door bacteriële cel biologen. De 2 voudige toename in resolutie 3-dimensioneel en de mogelijkheid om beeld tot 30 urn in een monster mogelijk maakt beeldvorming van hele bacteriën (en zoogdieren) cellen tijdens een experiment. Technieken zoals single-molecule lokalisatie die vaak worden uitgevoerd in de uitdovende golf kan de diepte van de penetratie niet bereiken in een monster en geen informatie over hele cellen niet bieden. Recente ontwikkelingen die hogere sampling diepten voor deze techniek toe kan resulteren in een betere axiale resolutie van hele cellen. Daarnaast single-molecule lokalisatie technieken die duizenden ruwe beelden te verwerven zijn ook beperkt in de framesnelheid die kunnen worden vastgelegd en kunnen compromis tussen capture framesnelheid en de uiteindelijke bereikte ruimtelijke resolutie vereisen, als de ruimtelijke resolutie nodig is afhankelijk van de aantal evegen opgenomen binnen een bepaalde ruimte. Vermindering van het aantal gemaakte opnamen zal resulteren in een lagere ruimtelijke resolutie, maar volstaan om de temporele resolutie die voor het biologisch proces plaats bereiken. De hoeveelheid hersteltijd tussen frames mogelijk ook worden verhoogd tot fototoxiciteit in levende cellen waardoor de duur en frequentie waarmee tijdreeksen can be obtained beperkend minimaliseren. Hoge resolutie technieken zoals elektronenmicroscopie (EM) of elektronen cryotomography (ECT) bieden hogere resolutie dan 3D-SIM-kaart (en andere super-resolutie optische microscopie technieken), maar moet worden uitgevoerd op vaste monsters. De vaststelling en de verwerking kan artefacten introduceren en het ontbreken van etikettering kan de interpretatie bemoeilijken. Labelvrije ECT slecht contrast en kan sample indringdiepte van ongeveer 500-200 nm 24 bereiken, dus zelfs als het eiwit van belang kan worden geïdentificeerd, kan de structuur van het eiwit in een volledige bacteriële cel kunnen worden waargenomen.Zelfs wanneer labeling kan worden gebruikt in EM, zoals bij immunogold, wordt de beeldvorming alleen plaats in 2D. 3D is alleen haalbaar met slijpplaatonderzoek en computationele reconstructie van de secties. De slijpplaatonderzoek vereist een ervaren technicus, maar kan problematisch zijn en leiden tot een artefact. Bij levende of gefixeerde cellen, ofwel 3D-SIM niet te worden ingebed in een specifieke wijze en cellen snel worden bereid voor beeldvorming in een bijna natieve toestand.
Deze werkwijze is relatief eenvoudig te implementeren door onderzoekers minimale ervaring in fluorescentiemicroscopie. Experimenten worden uitgevoerd in media die gezonde cel functie ondersteunen zolang het niet fluoresceert of genereren overmatige achtergrondsignaal. Voor bacteriële cellen, kan deze het gebruik van veel soorten complexe en minimaal medium of het gebruik van vaste of half-vaste media bacteriële celmotiliteit mogelijk. Veel biologen die al fluorescent proteïne (FP) fusies en de functionaliteit van de getestedeze fusies kan snel maken van deze technologie zonder verdere engineering en validatie van nieuwe fotoactiveerbare FP fusies. We vonden, als een algemene opmerking, dat S. aureus was gevoeliger voor fotobleking tijdens beeldvorming met FP fusies dan B. subtilis. Met behulp van onze oorspronkelijke 3D-SIM-methoden, waarbij het rasterpatroon werd gegenereerd door een fysieke raspen, we waren niet in staat om live cell imaging uitvoeren met een aantal van S. aureus FP fusies. Echter, met deze geavanceerde F3D-SIM-methode, waren we in staat om deze afbeelding FP fusies en voeren korte tijdreeksen om de dynamiek van deze gelabelde eiwitten vast te leggen. Dit is waarschijnlijk te wijten aan de verminderde belichtingstijd nodig voor beeldvorming en meer tijd tussen frames voor celherstel.
OMX Blaze 3D-SIM is een commercieel beschikbare technologie die relatief eenvoudig kan worden geïmplementeerd in een laboratorium of een kern beeldvormende faciliteit. Zorg moet worden genomen om de techniek uit te voeren om te voorkomen artifeiten als gevolg van slechte monstervoorbereiding of slechte beeld vast te leggen. Zodra de techniek beheerst kan studies van eiwitstructuur en dynamica in kleine organismen zoals bacteriën worden uitgevoerd in enkele of meerdere kleuren fluorescentie.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank P. Levin, S. Moriya, S. Foster, and M. Pinho for the gift of strains and antibodies. They also thank L. Ferrand, P. Goodwin, J. Cooper, and B. Dougherty for expert technical assistance. CBW is supported by an Australian National Health and Medical Research Council Senior Research Fellowship (571905). LT was supported by a UTS Chancellors Postdoctoral Fellowship. MPS and ATFL were supported by Australian Postgraduate Awards. This work was supported by an Australian Research Council Discovery Project Grant (DP120102010) to EJH.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Agarose I (Biotecnology grade) | AMRESCO | 0710-500G | Used for constructing 2% agarose pads. Use microwave to dissolve agarose in growth media |
N-(3-Triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(Diethylamino) Phenyl) Hexatrienyl) Pyridinium Dibromide (FM 4-64) | Life Technologies | T-13320 | Lipophylic dye used for staining cell membranes. |
1.5 ml microtube, graduated Natural | Scientific specialties Inc. | 1210-00 | Made from Homopolymer polypropylene, Used to harvest bacterial cells prior to being placed on agarose pads for visualization |
Luria broth base, Miller | BD | 241420 | Prepared according to manufacturer's instructions. Add 2%?? after autoclaving |
BBL Antibiotic assay broth, Antibiotic medium 3 | BD | 210932 | Prepared according to manufacturer's instructions. |
Adhesive frame | Thermo-Fisher Scientific | ABGAB-0577 | Known as Gene Frame with this company. Used to prepare 2% agarose pads (Dimensions: 15x16mm) |
Microscope cover glass | Thermo-Fisher Scientific | 111512-9 | 22×22 No 1 Thickness |
35 mm diameter petri dish with a glass coverslip bottom | World precision instruments | FD35-100 | Known as FluoroDish with this company. Dish: Ø35mm, Glass: Ø 23mm, Glass thickness: 0.17 mm, non pyrogenic |
Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378-25G | Make a 10 mg/ml stock in 95% Ethanol |
Lincomycin hydrochloride | Sigma | L6004-5MU | Make a 25 mg/ml stock in 50% Ethanol |
Erythromycin | Boehringer Mannheim GmbH | 12390120-14 | Make a 10 mg/ml stock in 95% Ethanol |
Combined Orbital/Linear Shaking waterbath | Grant scientific Instruments | OLS-200 | Shaking speed used for cultures: 215 rpm |
UV visible Spectrophotometer | Shimadzu | UV-1601 | 600 nm wavelength was used for measuring Optical density of bacterial cultures |
Centrifuge | Eppendorf | 5415R | Pellets of bacterial culture were obtained by spidding down mid exponentially growing cultures at 8000 for 30 seconds |
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma | 15502-10G | Prepare 1M stock and filter sterilze prior to use |
softWoRx software | Applied Precision Inc/A GE Healthcare Company | version 5.0 | |
Imaris data analysis software | Bitplane Scientific Software, Bitplane AG | version 7.0.0 | Matlab XTensions included |
DeltaVision OMX 3D-SIM imaging system fitted with a Blaze module. | Applied Precision Inc/A GE Healthcare Company | Blaze module fitted on OMX V3 | |
Upright fluorescence microscope | Zeiss Axioplan 2 |