Spatiotemporal information about dynamic proteins inside live cells is crucial for understanding biology. A type of super-resolution microscopy called fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM) reveals unique information about the cytokinetic Z ring in bacteria: both its bead-like appearance and the rapid dynamics of FtsZ within the ring.
Avbildning av biologiske prøver ved hjelp av fluorescens mikroskopi har avansert betydelig med nye teknologier for å overvinne oppløsningen barrieren av diffraksjon av lys, slik super-oppløsning på live-prøver. Det er i dag tre hovedtyper av super-oppløsning teknikker – stimulert emisjon mangel (STED), single-molekyl lokalisering mikroskopi (inkludert teknikker som PALM, STORM, og GDSIM), og strukturert belysning mikroskopi (SIM). Mens STED og enkelt-molekyl lokalisering teknikker viser den største økningen i oppløsning, de har vært tregere til å tilby økte hastigheter på bildet oppkjøpet. Tredimensjonal SIM (3D-SIM) er et bredt felt fluorescens mikroskopi teknikk som tilbyr en rekke fordeler fremfor både enkelt-molekyl lokalisering og STED. Oppløsning er forbedret, med typiske lateral og aksial oppløsning på 110 og 280 nm, henholdsvis og dybden av prøvetaking av opp til 30 mikrometer fra dekkglass, slik at foravbildning av hele celler. Nye fremskritt (rask 3D-SIM) i teknologien øke fangstrate på RAW-bilder tillater rask fangst av biologiske prosesser som skjer i løpet av sekunder, mens betydelig reduserer fototoksisitet og fotobleking. Her beskriver vi bruken av en slik fremgangsmåte til bilde bakterielle celler som inneholder fluorescensmerket merkede cytokinetic FtsZ protein for å vise hvordan cellene blir analysert, og den type av unik informasjon på at denne teknikk kan gi.
En rekke forskjellige avbildningsteknologier har vært brukt i løpet av årene for å studere bakterier, innbefattende forskjellige elektron og optisk mikroskopi-teknikker. Mens elektronmikroskopi har ekstremt høy oppløsning, ned til nanometer, har behovet for et vakuum, og bruk av kontrastmidler begrenses denne teknikken til faste og innvevde prøver. Gjenstander kan også bli introdusert på grunn av langvarige prøvepreparering og en dyktig utøver er nødvendig for å fremstille prøver, og til å analysere og tolke de resulterende bildene. Optisk mikroskopi tilbyr fordelene med enklere prøvepreparering og anvendelsen av flere etiketter med relativ letthet sammenlignet med elektronmikroskopi. Ved hjelp av fluorescerende proteiner og fargestoff konjugater, evnen til å studere levende celler med fluorescens mikroskopi er også mulig. Med forbedringer i fluoroforen stabilitet og fluorescerende protein størrelse / struktur fører til redusert celletoksisitet, samt fremskritt i kameragjenkjenning technology, fluorescens mikros bruke et vidt felt og konfokale bildesystemer har betydelig utvidet vår forståelse av romlige dynamikken i cellene. Ved å bruke disse teknikkene, er kunnskapen om den bakterielle cellen i løpet av de siste 20 år utviklet seg sterkt til en langt mer detaljert riss som viser en høy grad av strukturell og protein organisering innenfor bakteriecellen 1.
Imidlertid, konvensjonelle metoder for optisk mikroskopi er diffraksjon begrenset, noe som betyr at den iboende oppløsning er omtrent halvparten av bølgelengden til lyset som brukes eksitasjon. Følgelig, selv med de mest optimale konvensjonell optisk mikros system, er den beste lateral oppløsning ca 220 til 250 nm, og den aksielle oppløsning er omtrent 500 nm (for gjennomgang se Schermelleh et al. 2). For bakteriecelle biologer særlig dette fremdeles sterkt begrenser vår forståelse av den romlige organiseringen av disse ørsmå celler; blir bare 1-2 mikrometer i diameter og 1-10 um i lengde. Det er også behov for høyere teknikker oppløsning som kan utføres på levende celler hvor dynamiske romlige opptreden av et protein kan bli analysert for å komplettere in vitro-data.
I løpet av det siste tiåret har flere super-oppløsning fluorescens imaging teknikker blitt utviklet. Super-oppløsning mikros beskriver avbildningsteknikker at i det minste det dobbelte av lateral oppløsning kan oppnås med konvensjonelle lysmikroskopi, og derved overvinne diffraksjon barriere. Disse teknikkene manipulere belysning og / eller analyse av det utsendte lys til å lage ekte økning i den tilsynelatende oppløsning. Det er i dag tre hovedtyper av super-oppløsning teknikker – i) stimulert emisjon uttømming mikros 3 (STED); ii) single-molekyl lokalisering mikroskopi, inkludert teknikker som fotoaktivering lokalisering mikros 4,5 (PALM), stokastisk optisk gjenoppbygging mikros <sopp> 6 (STORM), direkte STORM 7 (dSTORM), og grunntilstanden uttømming med enkelt molekyl avkastning 8 (GDSIM); og iii) strukturert belysning mikros 9-12 (SIM). Single-molekyl lokalisering teknikker tilby de største økningene i lateral oppløsning, ned til mellom 10-40 nm i biologiske prøver. I mange implementasjoner av enkelt molekyl lokalisering mikroskopi, er dybden av prøvetakings begrenset til den flyktige bølgen og de innledende implementeringer av STED var også begrenset i prøvetakingsdybden. Imidlertid nylige fremskritt som for eksempel bruk av adaptiv optikk, utnyttelse av astigmatisme i punktspredefunksjon ved forskjellige brennpunkter, med flere plane deteksjon og ved hjelp av to formål å utlede den aksiale stilling av det utsendte lys har sett forbedringer i både aksial oppløsning og prøvetaking dybder i både STED og enkelt molekyl lokalisering 13,14. Oppkjøpsdatahastigheter for STED og enkelt-molekyl lokalisering teknikkerer også relativt treg på grunn av det store antallet bilder som må erverves for maksimal oppløsning (opp til 50.000 for lokalisering teknikker). Denne langsomme datainnsamling ikke egner seg til avbildning av levende prøver uten tilpassede modifikasjoner som ofte er ganske dyrt. Disse to teknikkene er for tiden optimalt egnet for faste prøver (for gjennomgang se 2,15), men mye arbeid som gjøres for å løse denne begrensningen.
Tredimensjonal strukturert belysning mikroskopi (3D-SIM) er et bredt felt teknikk som forbedrer både lateral og aksial oppløsning resulterer i en oppløsning på ca 110 og 280 nm, henholdsvis. Dybde av prøvetaking er opp til 30 mikrometer fra dekkglass, slik at for avbildning av hele celler. Variasjonen av 3D-SIM utviklet av Sedat, Agard, og Gustaffsson på plattformen optisk mikroskop eXperimental (OMX) innebærer belyse prøven med en kjent rutenett mønster som er flyttet inn i 15 forskjelligeposisjoner i hver z plan 9-11. Frynsene i de resulterende moaré som er opprettet i frekvens plass utenfor den observer regionen måles. Informasjonen fra frekvensområder som er beregnings rekonstruert for å generere en synlig super-oppløsning 10,11. Den relative hastigheten som de rå bildene kan bli kjøpt ved hjelp av denne teknikken muliggjør avbildning av levende celler. Det er imidlertid viktig å merke seg at for biologiske prosesser som forekommer i en tidsskala på sekunder, er anskaffelsen frekvensen av de rå bildene fremdeles er for treg til å fange opp dynamiske endringer. For tidsserier med en opptakshastighet sekunder, kan den gjentas oppkjøpet uten tilstrekkelig utvinning tid føre til fototoksisitet og fotobleking, spesielt under live avbildning av små bakterieceller.
For å overvinne disse problemene, har de siste fremskritt for rask 3D-SIM (F3D-SIM) blitt utviklet. Her beskriver vi en kjent som OMX Blaze 16 som var introduced sent 2011. Denne teknologi skaper det mønstrede belysning uten bruk av et fysisk nett som ble brukt i tidligere systemer. Bruken av forstyrrende lysstråler og ny lukkerteknologi gir mulighet for etablering av mønstret lys på prøven i en svært rask måte. Hastigheten på bildet oppkjøpet ble ytterligere forbedret med innføringen av vitenskapelig Complementary Metal Oxide Semiconductor (sCMOS) kameraer, særlig i forhold til de eksisterende EMCCD kameraer. Disse endringene medførte en mulig bilde oppkjøpet rate på ett bilde per sekund for en prøvetaking dybde på 1 mikrometer (512 x 512 piksler, 9 z-skiver), slik at overvåking av dynamiske endringer i celler som oppstår i løpet av sekunder 16. Nedgangen i den tilsynelatende eksponering (eksitasjon) ganger å leve celler ved hjelp av denne metoden kan enten lengre tidsserier for å bli fanget eller en økning i fangst rate.
Her beskriver vi anvendelsen av F3D-SIM mikros å examine struktur og dynamisk bevegelse av cytokinetic Z ringen i cellene i to bakteriearter: de stavformede modellorganisme Bacillus subtilis og kokkoid humant patogen Staphylococcus aureus. FtsZ er en tubulin-lignende cytoskeletal protein som spiller en nøkkelrolle i celledeling i bakterier 17,18. Det lokaliserer til delingen for å rekruttere minst 20 andre divisjons proteiner, danner delingen anordningen 17,18, og er antatt å tilveiebringe kraften for celle innsnevring 19-23. Dette viser at metoden FtsZ er heterogent fordelt rundt Z-ringen i begge organismer i en perle-liknende arrangement; å løse det lange holdte spørsmålet om Z-ringen er en kontinuerlig ensartet belte rundt cellen, som visualisert ved konvensjonell bred-felt fluorescens mikroskopi, eller en diskontinuerlig struktur som foreslått av elektron kryo-tomografi (ECT) 24. Vi viser hvordan evnen til 3D-SIM kan langt bedre romlig undersøkelse av bittesmå (enmikrometer diameter) runde celler som S. aureus som deles i tre etterfølgende vinkelrette plan (x, y, z). Time-lapse studier ved bruk av disse teknikker viser at strukturen i Z-ringen er dynamisk, med brutto organisering endringer innenfor ringen, heller enn FtsZ molekyler beveger seg inn og ut av et fast stillaset 24..
Fluorescent live cell imaging er et kraftig verktøy som gjør det mulig observasjon av dynamiske endringer i cellene over tid. Sanntids avbildning av bakteriecellebiologi har vært vanskelig på grunn av den lille cellestørrelse og redusert evne av de bakterielle cellene for å tåle gjentatt eksponering for eksiteringslys. F3D-SIM har utvidet verktøy tilgjengelig for å avhøre alle cellebiologi, men det er nødvendig å nøye utføre denne teknikken som gjenstander kan innføres dersom dårlig implementert. Det finnes en rekke viktige betraktninger for vellykket bruk av denne teknikken. Som det er en bred-felt fluorescens avbildningsmetode som baserer seg på bruk av punktet spre funksjon av det utsendte lys, brytningsindeks mismatch og sfærisk aberrasjon av det avgitte lys, må unngås for å muliggjøre nøyaktig bilde rekonstruksjon. Bruken av dekkglass på 0,17 mm tykkelse på en høy kvalitet for å unngå variasjon i signalintensitet på grunn av variasjoner i glasstykkelse dekslerleppe er sterkt anbefalt. Det er kritisk viktig å nøye vurdere sfærisk aberrasjon av lyset i de innledende stadier av alle eksperimenter og justere immersjonsolje brytningsindeks etter behov. Dette kan variere fra dag-til-dag som det er avhengig av både temperatur og monterings media / substrat av prøven. Bruken av den uriktige olje vil resultere i dårligere rekonstruksjon av bildene med gjenstander slik som halo og ekkosignaler.
Ved slutten av bildet gjenoppbyggingen, for hver fase er et mål på kvaliteten av rekonstruksjonen kan oppnås ved den "beste tilpasning for kO vinkel" for hver fase / vinkel på belysning. Dersom denne verdien er mindre enn 1 for hver vinkel, da kvaliteten av den rekonstruerte vil mest sannsynlig være høy. Hvis denne verdien er over 6, er det mest sannsynlig at den rekonstruerte bildet vil inneholde gjenstander. Vanlige gjenstander omfatter i) utseende av striper i bildet som korresponderertil en av vinklene i rutenettet. Dette kan skyldes lavere signal fra at gitteret vinkel; ii) haloing rundt strukturer. Dette kan skyldes meget ujevn nivåer av signalet fra de lyse strukturer i forhold til omkringliggende strukturer, en mismatch av brytningsindeksen for olje og prøven, eller kan være på grunn av strukturene i bildet blir for amorf og ikke inneholdende nok "struktur" å bli gjenkjent ved hjelp av algoritmen; iii) 'honeycombing' som resulterer fra et lavt signal til støyforhold i bildet, vanligvis på grunn av høy bakgrunn signal; iv) strukturer som er strukket i / avlange xy som kan være på grunn av brytningsindeksen mismatch av olje og prøven. Denne gjenstanden er vanskelig å skjelne for en uerfaren bruker. Det anbefales at nye brukere konsultere en erfaren SIM forsker for råd om bildetolkning og analyse når du begynner å bruke denne teknikken.
Som med alle fluorescerende levende celler avbildnings eksperimenter, er det importmaur å nøye balansere eksitasjon energitilførsel for å minimalisere graden av fotobleking og fototoksisitet av cellene med tilstrekkelig emisjonssignal er nødvendig for å rekonstruere bilder med minimal artefakt. Overdreven fotobleking (større enn 30% på tvers av en enkelt Z-stabel anskaffelse) vil føre til en stripemønster i det rekonstruerte bildet. Med bruk av sCMOS kameraer, kan super-oppløsning med hell rekonstruert fra rå bilder med utslipp signal så lavt som 1000-tall over bakgrunnen. Dette kan tillate for meget korte eksponeringstider for derved å redusere fotobleking og muliggjør rask fangst for hver ramme. Det øker også mengden av tid mellom rammer for celler å gjenopprette fra eksitasjon energi. I tillegg, som fangsttiden for hver enkelt ramme kan være meget kort, er graden av gjenstanden innføres ved 'bevegelse uklarhet "under en individuell fangst reduseres med bruk av denne metoden.
Dette Variasjon av 3D-SIM tilbyr en rekke andre fordeler fremfor andre tilgjengelige super og høy oppløsning imaging teknologi for direkte avbildning av bakteriell cellebiologer. Den 2-ganger økning i oppløsning i alle tre dimensjoner, og evnen til å bilde på opptil 30 um inn i en prøve muliggjør avbildning av hele bakterier (og pattedyr)-celler i løpet av et eksperiment. Teknikker slik som enkelt-molekyl lokalisering som vanligvis utføres i den flyktige bølge ikke kan oppnå dybden av gjennomtrengning inn i en prøve og ikke gir informasjon om hele celler. Nylige fremskritt som tillater høyere samplingdybder for denne teknikken kan føre til bedre aksial oppløsning på hele celler. I tillegg er enkelt-molekyl lokaliseringsteknikker som krever tusenvis av rå bilder som skal erverves er også begrenset i bildefrekvensen som kan fanges opp og kan kreve kompromiss mellom opptaksbildefrekvens og den endelige oppnådde romlig oppløsning, som den romlige oppløsningen er avhengig antall eveNTS registrert innenfor en definert plass. Reduksjon av antall fangede rammer vil resultere i et lavere romlig oppløsning, men kan være tilstrekkelig til å oppnå den tidsmessig oppløsning er nødvendig for den biologiske prosess er av interesse. Mengden av utvinning tid mellom rammer kan også være nødvendig å øke for å minimere fototoksisitet i levende celler og dermed begrense varigheten og frekvensen som tidsserier kan skaffes. Høyoppløselige teknikker som elektronmikroskopi (EM) eller elektron cryotomography (ECT) gir økt oppløsning i 3D-SIM (og andre super-oppløsning optiske mikroskopi teknikker), men må utføres på faste prøver. Fikse og prosessering kan introdusere artefakter og mangel på merking kan gjøre tolkningen av resultatene vanskelig. Etikett-fri ECT har dårlig kontrast og kan oppnå prøvepenetreringsdybder på omkring 500 til 200 nm 24, slik at selv om for proteinet av interesse kan bli identifisert, kan strukturen av proteinet i en hel bakteriecellen ikke observeres.Selv når merking kan anvendes i EM, for eksempel med en immun, blir avbildning kun utføres i 2D. 3D er bare oppnåelig med tynn seksjonering og beregnings rekonstruksjon av delene. Den tynne seksjonering krever en erfaren tekniker, men kan være problematisk og føre til artefakter. Med levende eller faste celler, gjør 3D-SIM trenger ikke å være forankret i en bestemt måte og celler kan raskt forberedt for bildebehandling i en nær naturlig tilstand.
Denne fremgangsmåte er forholdsvis enkel å gjennomføre ved forskere med minimal erfaring fluorescerende mikroskopi. Eksperimenter kan utføres i medier som støtter sunn cellefunksjon, så lenge den ikke fluorescerer eller generere utilbørlig bakgrunnssignal. For bakterieceller, kan dette tillater bruk av mange typer av komplekse og minimalt medium, eller ved bruk av faste eller semi-fast medium for å kontrollere bakteriecelle motilitet. Mange biologer som allerede har utviklet fluorescerende protein (FP) fusjoner og testet funksjonalitetendisse fusjoner kan ta opp denne teknologien raskt uten videre prosjektering og validering med nye photoactivatable FP fusjoner. Vi fant, som en generell observasjon, at S. aureus var mer utsatt for fotobleking under bildebehandling med FP fusjoner enn B. subtilis. Ved hjelp av vår opprinnelige 3D-SIM-metoder, der rutenett mønster ble generert av en fysisk rist, var vi ikke i stand til å opptre live cell imaging med en rekke S. aureus FP fusjoner. Men med denne avanserte F3D-SIM-metoden, kunne vi image disse FP fusjoner og utføre korte tidsserier for å fange dynamikken i disse merkede proteiner. Dette er mest sannsynlig på grunn av den reduserte eksponeringstider som trengs for bildebehandling og økt tid mellom rammer for celle utvinning.
OMX Blaze 3D-SIM er en kommersielt tilgjengelig teknologi som kan relativt enkelt implementeres i en enkelt laboratorium eller en kjerne bildestudio. Hensyn må tas for å utføre teknikken for å unngå artifakta på grunn av dårlig bildefangst dårlig prøveopparbeidelse eller. Når teknikken beherskes, kan studier av proteinstruktur og dynamikk i små organismer som bakterier bli utført i enkelt eller flerfarge fluorescens.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank P. Levin, S. Moriya, S. Foster, and M. Pinho for the gift of strains and antibodies. They also thank L. Ferrand, P. Goodwin, J. Cooper, and B. Dougherty for expert technical assistance. CBW is supported by an Australian National Health and Medical Research Council Senior Research Fellowship (571905). LT was supported by a UTS Chancellors Postdoctoral Fellowship. MPS and ATFL were supported by Australian Postgraduate Awards. This work was supported by an Australian Research Council Discovery Project Grant (DP120102010) to EJH.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Agarose I (Biotecnology grade) | AMRESCO | 0710-500G | Used for constructing 2% agarose pads. Use microwave to dissolve agarose in growth media |
N-(3-Triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(Diethylamino) Phenyl) Hexatrienyl) Pyridinium Dibromide (FM 4-64) | Life Technologies | T-13320 | Lipophylic dye used for staining cell membranes. |
1.5 ml microtube, graduated Natural | Scientific specialties Inc. | 1210-00 | Made from Homopolymer polypropylene, Used to harvest bacterial cells prior to being placed on agarose pads for visualization |
Luria broth base, Miller | BD | 241420 | Prepared according to manufacturer's instructions. Add 2%?? after autoclaving |
BBL Antibiotic assay broth, Antibiotic medium 3 | BD | 210932 | Prepared according to manufacturer's instructions. |
Adhesive frame | Thermo-Fisher Scientific | ABGAB-0577 | Known as Gene Frame with this company. Used to prepare 2% agarose pads (Dimensions: 15x16mm) |
Microscope cover glass | Thermo-Fisher Scientific | 111512-9 | 22×22 No 1 Thickness |
35 mm diameter petri dish with a glass coverslip bottom | World precision instruments | FD35-100 | Known as FluoroDish with this company. Dish: Ø35mm, Glass: Ø 23mm, Glass thickness: 0.17 mm, non pyrogenic |
Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378-25G | Make a 10 mg/ml stock in 95% Ethanol |
Lincomycin hydrochloride | Sigma | L6004-5MU | Make a 25 mg/ml stock in 50% Ethanol |
Erythromycin | Boehringer Mannheim GmbH | 12390120-14 | Make a 10 mg/ml stock in 95% Ethanol |
Combined Orbital/Linear Shaking waterbath | Grant scientific Instruments | OLS-200 | Shaking speed used for cultures: 215 rpm |
UV visible Spectrophotometer | Shimadzu | UV-1601 | 600 nm wavelength was used for measuring Optical density of bacterial cultures |
Centrifuge | Eppendorf | 5415R | Pellets of bacterial culture were obtained by spidding down mid exponentially growing cultures at 8000 for 30 seconds |
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma | 15502-10G | Prepare 1M stock and filter sterilze prior to use |
softWoRx software | Applied Precision Inc/A GE Healthcare Company | version 5.0 | |
Imaris data analysis software | Bitplane Scientific Software, Bitplane AG | version 7.0.0 | Matlab XTensions included |
DeltaVision OMX 3D-SIM imaging system fitted with a Blaze module. | Applied Precision Inc/A GE Healthcare Company | Blaze module fitted on OMX V3 | |
Upright fluorescence microscope | Zeiss Axioplan 2 |