En fremgangsmåde til frembringelse Pulmonal Neutrofili Brug Aerosolized Lipopolysaccharid

Summary

Vi beskriver en fremgangsmåde til at inducere neutrofil pulmonal inflammation ved udfordring aerosoliseret lipopolysaccharid ved forstøvning, at modellere akut lungeskade. Desuden er grundlæggende kirurgiske teknikker til lunge isolation, tracheal intubation og bronchoalveolær lavage også beskrevet.

Abstract

Akut lungeskade (ALI) er en alvorlig sygdom karakteriseret ved alveolær neutrofili, med begrænsede behandlingsmuligheder og høj dødelighed. Eksperimentelle modeller af ALI er nøglen til at øge vores forståelse af sygdommen patogenese. Lipopolysaccharid (LPS) fra gram-positive bakterier inducerer neutrofil inflammation i luftvejene og lungeparenkym af mus. Effektiv pulmonal levering af forbindelser, såsom LPS er imidlertid vanskeligt at opnå. I den fremgangsmåde der er beskrevet her, er pulmonal tilførsel i mus opnås ved udfordring for aerosoliseret Pseudomonas aeruginosa LPS. Opløst LPS blev aerosoliseret af en forstøver forbundet til trykluft. Mus blev udsat for en kontinuerlig strøm af LPS aerosol i en plexiglas kasse i 10 minutter, efterfulgt af 2 minutters konditionering efter aerosolen blev afbrudt. Trakealintubation og efterfølgende bronchoalveolær lavage, efterfulgt af formalin perfusion blev dernæst udført, hvilket tillader karakterisering af den sterile pulmonary inflammation. Aerosoliseret LPS genererer en pulmonal inflammation karakteriseret ved alveolær neutrofili, detekteret i bronchoalveolær udskylning og histologisk vurdering. Denne teknik kan sættes op på en lille pris med få apparater, og kræver minimal træning og ekspertise. Eksponeringen Systemet kan således rutinemæssigt på ethvert laboratorium, med potentiale til at øge vores forståelse af lunge patologi.

Introduction

Lipopolysaccharid (LPS) er en cellevægsbestanddel af gramnegative bakterier ^1. Challenge LPS er en veldokumenteret model for akut lungeskade, et syndrom karakteriseret ved akut neutrofil inflammation og ødem ^2. Desuden pulmonal neutrofili er også et kendetegn for kronisk obstruktiv lungesygdom (COPD) ^3, og LPS-provokationen i mennesker er blevet anvendt til at modellere KOL forværringer ^4. Således eksperimentelle modeller af LPS eksponering er klinisk relevante og værdifulde værktøjer til at forstå den menneskelige patologi.

Formålet med den pulmonale levering af aerosoliserede LPS beskrevet her er at generere en neutrofil inflammatorisk respons i den ledende og luftvejene, uden systemisk involvering. Adskillige teknikker til LPS-provokationen er blevet beskrevet tidligere. Intravenøs injektion af LPS er den mest almindeligt anvendte indgivelsesvej. Selv om denne teknik er let tilgængelig, than primære skade på endotelet, med sekundær ødelæggelse af lungeepitelet efter neutrofil migration til lungen. Intravenøs administration inducerer også systemisk inflammation ^2, som kan komplicere det kliniske billede i dyremodeller. Systemisk inflammation er i modsætning ikke observeret med intratracheal administration. Denne teknik er imidlertid arbejdskrævende og kræver anæstesi samt en betydelig træning ^{5, 6.} Desuden pulmonal deposition af denne administrationsvej afhænger af vejrtrækning ^7. Således lungeaflejring påvirket af dybden af ​​bedøvelse er nødvendige for kan observeres intra administration luftrør og variabel aflejring i luftvejene. I modsætning hertil pulmonal levering med aerosoliserede LPS kræver minimal træning, og kan let opnås på et stort antal dyr med lille eller ingen variation mellem individer ^{5, 8.}En nylig undersøgelse viser, at aerosol levering er overlegen i forhold til intratracheal rute med hensyn til aflejring, og at mere relevante doser af LPS inducerer neutrofil inflammation med denne model ^8.

Tidligere undersøgelser har vist, at udfordring for aerosoliseret Pseudomonas aeruginosa LPS genererer en markant inflammatorisk reaktion i luftvejslumen og lungeparenkym, herunder alveolære rum ^{9, 10.} Inflammationen er kendetegnet ved en overvægt af neutrofiler og tilstedeværelsen af ​​lungeødem, og kan således anvendes til at behandle patogenesen af ​​akut lungeskade og få yderligere kendskab til de mekanismer, der bidrager til sygdommen patologi.

Protocol

Undersøgelserne dyr blev godkendt af Nordlige Stockholm dyrevelfærd etiske udvalg. De eksperimentelle procedurer blev udført i overensstemmelse med den svenske lovgivning. 1. Generering en LPS Aerosol 0,5 g oprenset P. Opløs aeruginosa LPS i 50 ml sterilt saltvand under forsigtig omrøring og kontrollere opløsning. Fortyndes 1 ml opløst LPS i 9 ml sterilt saltvand til en slutkoncentration på 1 mg / ml. Beskyt mod lys med alufolie og opbevares ved -20 ° C….

Representative Results

Udfordring til aerosoliseret P. aeruginosa LPS giver normalt en markant inflammatorisk reaktion i luftvejslumen og alveolære rum, kendetegnet ved en overvægt af neutrofiler på både tidlige og sene tidspunkter. Aerosoliseret LPS inducerer pulmonal neutrofili C57BL / 6by og BALB / c-mus blev udsat for aerosoliseret P. aeruginosa LPS eller alene køretøjet og neutrofiler blev optalt i BALF. Det samlede celleantal i BALF af C57BL / 6by mus udsat f…

Discussion

Aerosoliseret LPS genererer et inflammatorisk respons i luftvejene, kendetegnet ved, neutrofiler i epitel submucosa, rum omkring de ledende luftveje, samt de alveolære rum. Dette er, sammen med den øgede totale proteinindhold i BALF, indikerer plasmalækage, repræsentant for patologien af ​​akut lungeskade. Som LPS inducerer en steril inflammation, reaktionen er uafhængig af det adaptive immunrespons, og der er begrænsninger for relevans for bakterielle infektioner. Teknikken kan dog anvendes til at dissekere i…

Materials

Name of the material/equipment	Company	Catalog number	Comments/Description
Purified Pseudomonas aeruginosa LPS	Sigma-Aldrich		Harmful. Recomended purification. LPS purified from other bactria may be used.
Pari LC sprint star nebulizer	PARI Respiratory Equipment Inc.	023G1250
TSI mass flowmeter 4040	TSI	4040	Alternative product from supplier may be used.
Saint-Gobain 15.9 mm Tygon tube	Sigma-Aldrich	Z685704	Recomended brand.
Plexiglas boxes with removable lids	Custom built	N/A	150 x 163 x 205 mm (a 2 mm hole on the side).
3M Half Facepiece Reusable Respirator	3M	7503	Recomended brand.
3M Advanced Particulate Filters (P100)	3M	2291	Recomended brand.
Sissors	VWR	233-1104	Preferred scissors may be used.
Forceps	VWR	232-1313	Preferred forceps may be used.
Intramedic PE50 polyethylene tube	BD	427411	Recomended brand.
Ethicon 2-0 Perma-hand silk tread	VWR	95056-992	Recomended brand.
26 ½  gage needle			Alternative suppliers exist.
1 mL BD slip-tip syringe, non-sterile	BD	301025	Alternative suppliers exist.
60 mL BD Luer-Lok syringe, non-sterile, polypropolene	BD	301035	Alternative suppliers exist.
Fluka Hematoxylin-Eosin	Sigma-Aldrich	3972	Alternative suppliers exist.
Türk's solution	Merck Millipore	109277
Table top centrifuge			Alternative manufacturers exist.
Cytospin 4 cytocentrifuge	Thermo Scientific	A78300003	Alternative centrifuge can be used.
HEMA-3 stat pack	Fisher Scientific	23-123-869	Alternative staining kits exists.
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128	Alternative suppliers exist.