Un método para generar pulmonar Neutrofilia Usando aerosol lipopolisacárido

Summary

Se describe un método para inducir la inflamación pulmonar neutrofílica por desafío para el lipopolisacárido de aerosol por nebulización, para modelar la lesión pulmonar aguda. Además, también se describen técnicas quirúrgicas básicas para la separación de pulmón, la intubación traqueal y lavado broncoalveolar.

Abstract

La lesión pulmonar aguda (ALI) es una enfermedad grave caracterizada por neutrofilia alveolar, con opciones de tratamiento limitadas y una elevada mortalidad. Los modelos experimentales de ALI son clave para mejorar nuestra comprensión de la patogénesis de la enfermedad. El lipopolisacárido (LPS) derivadas de bacterias gram positivas induce la inflamación neutrofílica en las vías respiratorias y parénquima pulmonar de los ratones. La administración pulmonar eficiente de compuestos tales como LPS es, sin embargo, difícil de lograr. En el método descrito aquí, la administración pulmonar en ratones se logra mediante desafío para aerosol Pseudomonas aeruginosa LPS. Disuelto LPS fue aerosol mediante un nebulizador conectado a aire comprimido. Los ratones fueron expuestos a un flujo continuo de LPS aerosol en una caja de plexiglás durante 10 min, seguido de 2 min acondicionado después se suspendió el aerosol. La intubación traqueal y posterior lavado broncoalveolar, seguido de una perfusión de formalina se realizaron siguiente, que permite la caracterización de la p estérilinflamación ulmonary. Aerosol LPS genera una inflamación pulmonar que se caracteriza por neutrofilia alveolar, detectado en el lavado broncoalveolar y por evaluación histológica. Esta técnica se puede configurar en un pequeño coste con unos aparatos, y requiere una formación mínima y experiencia. El sistema de exposición de este modo se puede realizar de forma rutinaria en un laboratorio, con el potencial de mejorar nuestra comprensión de la patología pulmonar.

Introduction

El lipopolisacárido (LPS) es un componente de la pared celular de las bacterias gram negativas ^1. Desafío a LPS es un modelo bien documentado de la lesión pulmonar aguda, un síndrome caracterizado por la inflamación neutrofílica aguda y edema ^2. Además, neutrofilia pulmonar es también una característica de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) ^3, y el desafío LPS en los seres humanos se ha utilizado para modelar las exacerbaciones de EPOC ^4. Así, los modelos experimentales de la exposición LPS son clínicamente relevantes y herramientas valiosas para entender la patología humana.

El objetivo de la administración pulmonar de aerosol LPS descritas aquí es generar una respuesta inflamatoria neutrofílica en la realización y vías respiratorias, sin afectación sistémica. Varias técnicas de exposición a LPS se han descrito anteriormente. Inyección intra-venosa de LPS es la ruta más común de administración. Aunque esta técnica es fácilmente accesible, tél daño primario es al endotelio, con la destrucción secundaria del epitelio pulmonar después de la migración de neutrófilos al pulmón. Administración intra-venosa también induce la inflamación sistémica ^2, lo que puede complicar el cuadro clínico en modelos animales. La inflamación sistémica está en contraste no observado con la administración intra-traqueal. Esta técnica, sin embargo, es una labor intensiva y requiere anestésicos así como una considerable formación ^{5, 6.} Además, la deposición pulmonar por esta vía de administración depende de la respiración ^7. Por lo tanto, la deposición pulmonar se ve afectada por la profundidad de la anestesia necesaria para se pueden observar la administración traqueal intra y deposición variable en las vías respiratorias. En contraste, la administración pulmonar con LPS en aerosol requiere una formación mínima, y se puede lograr fácilmente en un gran número de animales con poca o ninguna variación entre individuos ^{5, 8.}Un estudio reciente confirma que la administración en aerosol es superior a la ruta intra-traqueal con respecto a la deposición, y que las dosis más relevantes de LPS induce la inflamación neutrofílica con este modelo ^8.

Estudios anteriores han demostrado que desafío para aerosol Pseudomonas aeruginosa LPS genera una respuesta inflamatoria marcada en el lumen de la vía aérea y parénquima pulmonar, incluyendo los espacios alveolares ^{9, 10.} La inflamación se caracteriza por el predominio de neutrófilos y la presencia de edema pulmonar, y por lo tanto se puede utilizar para hacer frente a la patogénesis de la lesión pulmonar aguda y adquirir un mayor conocimiento de los mecanismos que contribuyen a la patología de la enfermedad.

Protocol

Los estudios con animales fueron aprobados por el comité de ética de bienestar animal Estocolmo norte. Los procedimientos experimentales se realizaron en cumplimiento de la legislación sueca. 1. Generación de un Aerosol LPS Disolver 0,5 g purificado P. aeruginosa LPS en 50 ml de solución salina estéril con agitación suave y verificar la disolución. Diluir 1 ml disueltos LPS en 9 ml de solución salina estéril, a una concentración final de 1 mg / ml. Proteger de …

Representative Results

Desafío a aerosol P. aeruginosa LPS por lo general produce una marcada respuesta inflamatoria en el lumen de las vías respiratorias y el espacio alveolar, que se caracteriza por el predominio de neutrófilos en ambos puntos temporales tempranos y tardíos. Aerosol LPS induce neutrofilia pulmonar Ratones C57BL / 6BY y BALB / c fueron expuestas a aerosol P. aeruginosa LPS o vehículo solo y neutrófilos se enumeran en BALF. El número total de cél…

Discussion

Aerosol LPS genera una respuesta inflamatoria en las vías respiratorias, que se caracteriza por los neutrófilos en la submucosa epitelial, espacios que rodean las vías respiratorias conductoras, así como los espacios alveolares. Esto es, junto con el aumento del contenido de proteína total en BALF, indicativo de pérdida de plasma, representante de la patología de la lesión pulmonar aguda. Como LPS induce una inflamación estéril, la reacción es independiente de la respuesta inmune adaptativa, y hay limitacione…

Materials

Name of the material/equipment	Company	Catalog number	Comments/Description
Purified Pseudomonas aeruginosa LPS	Sigma-Aldrich		Harmful. Recomended purification. LPS purified from other bactria may be used.
Pari LC sprint star nebulizer	PARI Respiratory Equipment Inc.	023G1250
TSI mass flowmeter 4040	TSI	4040	Alternative product from supplier may be used.
Saint-Gobain 15.9 mm Tygon tube	Sigma-Aldrich	Z685704	Recomended brand.
Plexiglas boxes with removable lids	Custom built	N/A	150 x 163 x 205 mm (a 2 mm hole on the side).
3M Half Facepiece Reusable Respirator	3M	7503	Recomended brand.
3M Advanced Particulate Filters (P100)	3M	2291	Recomended brand.
Sissors	VWR	233-1104	Preferred scissors may be used.
Forceps	VWR	232-1313	Preferred forceps may be used.
Intramedic PE50 polyethylene tube	BD	427411	Recomended brand.
Ethicon 2-0 Perma-hand silk tread	VWR	95056-992	Recomended brand.
26 ½  gage needle			Alternative suppliers exist.
1 mL BD slip-tip syringe, non-sterile	BD	301025	Alternative suppliers exist.
60 mL BD Luer-Lok syringe, non-sterile, polypropolene	BD	301035	Alternative suppliers exist.
Fluka Hematoxylin-Eosin	Sigma-Aldrich	3972	Alternative suppliers exist.
Türk's solution	Merck Millipore	109277
Table top centrifuge			Alternative manufacturers exist.
Cytospin 4 cytocentrifuge	Thermo Scientific	A78300003	Alternative centrifuge can be used.
HEMA-3 stat pack	Fisher Scientific	23-123-869	Alternative staining kits exists.
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128	Alternative suppliers exist.