En metod för att generera Pulmonell neutrofili Använda aerosoliserad Lipopolysackarid

Summary

Vi beskriver en metod för att inducera neutrofil pulmonell inflammation genom utmaning för aerosoliserad lipopolysackarid genom nebulisering, att modellera akut lungskada. Dessutom är grundläggande kirurgiska tekniker för lung- isolering, trakeal intubering och bronkoalveolärt lavage också beskrivits.

Abstract

Akut lungskada (ALI) är en allvarlig sjukdom som kännetecknas av alveolär neutrofili, med begränsade behandlingsalternativ och hög dödlighet. Experimentella modeller av ALI är nyckeln för att öka vår förståelse av sjukdomen patogenes. Lipopolysackarid (LPS) härrörande från grampositiva bakterier inducerar neutrofil inflammation i luftvägarna och lungparenkym av möss. Effektiv pulmonal tillförsel av föreningar, såsom LPS är dock svårt att uppnå. I den metod som beskrivs här, är pulmonell leverans i möss uppnås genom utmaning för aerosoliserad Pseudomonas aeruginosa LPS. Löst LPS aerosol genom en nebulisator kopplad till tryckluft. Möss utsattes för ett kontinuerligt flöde av LPS aerosol i en plexiglaslåda i 10 min, följt av 2 min konditionering efter aerosol avbröts. Trakealintubation och efterföljande lungsköljning, följt av formalin perfusion var nästa utförts, vilket möjliggör för karakterisering av den sterila pulmonary inflammation. Aerosolform LPS genererar en lunginflammation som kännetecknas av alveolär neutrofili, upptäcktes i bronkoalveolärt lavage och genom histologisk bedömning. Denna teknik kan sättas upp till en liten kostnad med få apparater, och kräver minimal utbildning och kompetens. Exponeringssystemet kan således rutinmässigt vid alla laboratorier, med potential att öka vår förståelse av lungpatologi.

Introduction

Lipopolysackarid (LPS) är en cellväggkomponent av gramnegativa bakterier ^1. Utmaning till LPS är en väldokumenterad modell av akut lungskada, ett syndrom som kännetecknas av akut neutrofil inflammation och ödem ^2. Dessutom är lung neutrofili också ett kännetecken för kronisk obstruktiv lungsjukdom (KOL) ^3, och LPS utmaningen hos människa har använts för att modellera KOL exacerbationer ^4. Således experimentella modeller av LPS exponering är kliniskt relevanta och värdefulla verktyg för att förstå människans patologi.

Syftet med pulmonell leverans av aerosolform LPS beskrivs här är att generera en neutrofil inflammatoriskt svar i ledande och andningsvägarna, utan systemiskt engagemang. Flera tekniker för LPS-utmaning har beskrivits tidigare. Intra-venös injektion av LPS är den mest använda administreringssättet. Även om denna teknik är lättillgänglig, tHan primär skada är att endotelet, med sekundär förstörelse av lung epitel efter neutrofilmigrationen till lungan. Intravenös administrering inducerar även systemisk inflammation ^2, vilket kan komplicera den kliniska bilden i djurmodeller. Systemisk inflammation står i kontrast inte observerats med intratrakeal administration. Denna teknik är dock arbetsintensiv och kräver bedövningsmedel samt betydande utbildning ^{5, 6.} Dessutom är lung nedfall genom denna administreringsväg beroende andning ^7. Således är lung nedfall påverkas av anestesidjupet behövs för intra trakeal administration och rörlig nedfall i luftvägarna kan observeras. Däremot kräver pulmonell leverans med aerosolform LPS minimal utbildning, och kan lätt åstadkommas på ett stort antal djur med liten eller ingen variation mellan individer ^{5, 8.}En färsk studie bekräftar att aerosoltillförsel är överlägsen den intratrakeal väg när det gäller deponering, och att mer relevanta doser av LPS inducerar neutrofil inflammation med denna modell ^8.

Tidigare studier har visat att utmaningen till aerosolisPseudoMonas aeruginosa LPS alstrar en markerad inflammatoriskt svar i luftvägslumen och lungparenkym, däribland de alveolära utrymmena ^{9, 10.} Inflammationen karakteriseras av en övervikt av neutrofiler och förekomst av lungödem, och kan således användas för att ta itu med patogenes av akut lungskada och uppnå ytterligare kunskap om de mekanismer som bidrar till sjukdomspatologin.

Protocol

Djurstudier har godkänts av Norra Stockholms djurskydds etisk kommitté på. De experimentella procedurer utfördes i enlighet med Svensk lag. 1. Att utveckla en LPS Aerosol Lös 0,5 g renad P. aeruginosa LPS i 50 ml steril koksaltlösning under försiktig omrörning och verifiera upplösningen. Späd 1 ml upplösta LPS i 9 ml steril saltlösning, till en slutlig koncentration av 1 mg / ml. Skyddas från ljus med aluminiumfolie och förvara vid -20 ° C. Tina s…

Representative Results

Utmaning till aerosoliserad P. aeruginosa LPS ger oftast en markerad inflammatorisk reaktion i luftvägslumen och alveolär utrymme, som kännetecknas av en dominans av neutrofiler vid både tidiga och sena tidpunkter. Aerosolform LPS inducerar pulmonell neutrofili C57BL / 6BY och BALB / c-möss exponerades för aerosoliserad P. aeruginosa LPS eller ensam fordonet och neutrofiler räknades i BALF. Det totala antalet celler i BALF av C57BL / 6BY mö…

Discussion

Aerosoliserad LPS genererar en inflammatorisk reaktion i luftvägarna, som kännetecknas av neutrofiler i epitelial submukosa, utrymmen som omger luftvägarna, liksom de alveolära utrymmena. Detta är, tillsammans med den ökade totala proteininnehållet i BALF, ett tecken på plasmaläckage, representativ för patologi av akut lungskada. Som LPS inducerar en steril inflammation, är reaktionen oberoende av det adaptiva immunsvaret, och det finns begränsningar för relevans för bakterieinfektioner. Tekniken kan emell…

Materials

Name of the material/equipment	Company	Catalog number	Comments/Description
Purified Pseudomonas aeruginosa LPS	Sigma-Aldrich		Harmful. Recomended purification. LPS purified from other bactria may be used.
Pari LC sprint star nebulizer	PARI Respiratory Equipment Inc.	023G1250
TSI mass flowmeter 4040	TSI	4040	Alternative product from supplier may be used.
Saint-Gobain 15.9 mm Tygon tube	Sigma-Aldrich	Z685704	Recomended brand.
Plexiglas boxes with removable lids	Custom built	N/A	150 x 163 x 205 mm (a 2 mm hole on the side).
3M Half Facepiece Reusable Respirator	3M	7503	Recomended brand.
3M Advanced Particulate Filters (P100)	3M	2291	Recomended brand.
Sissors	VWR	233-1104	Preferred scissors may be used.
Forceps	VWR	232-1313	Preferred forceps may be used.
Intramedic PE50 polyethylene tube	BD	427411	Recomended brand.
Ethicon 2-0 Perma-hand silk tread	VWR	95056-992	Recomended brand.
26 ½  gage needle			Alternative suppliers exist.
1 mL BD slip-tip syringe, non-sterile	BD	301025	Alternative suppliers exist.
60 mL BD Luer-Lok syringe, non-sterile, polypropolene	BD	301035	Alternative suppliers exist.
Fluka Hematoxylin-Eosin	Sigma-Aldrich	3972	Alternative suppliers exist.
Türk's solution	Merck Millipore	109277
Table top centrifuge			Alternative manufacturers exist.
Cytospin 4 cytocentrifuge	Thermo Scientific	A78300003	Alternative centrifuge can be used.
HEMA-3 stat pack	Fisher Scientific	23-123-869	Alternative staining kits exists.
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128	Alternative suppliers exist.